天然脂肪酸是特别有趣的结构单元，近年来，用于脂肪酸转化的生物催化方法迅速发展(图1)。例如，脂肪酸脱羧酶OleT和UndA/B的发现，可以从脂肪酸合成末端烯烃；使用P450单加氧酶、过加氧酶或双加氧酶可实现脂肪酸羟基化；不饱和脂肪酸的羟基官能化也可以通过选择性地向顺式C=C双键加水或形成烯丙基氢过氧化物，然后通过C-C键裂解或异构化形成二醇来实现；还可以将羧酸盐选择性还原成醇或醛；利用脂肪酶的“过水解酶”活性对不饱和脂肪酸进行酶促环氧化等。

图1. 天然脂肪酸作为结构单元. a. 水解酶催化的酰胺化; b. 还原酶催化羧酸盐还原成相应的醛和醇; c. P450过氧化酶催化的氧化脱羧产生末端烯烃; d. 光脱羧酶催化的脱羧产生烷烃; e. 水合酶催化的将水加到C=C双键; f. 脂氧合酶催化烯丙基氢过氧化; g. 使用单加氧酶、双加氧酶和过加氧酶进行末端羟基化，并进一步转化为酸或胺作为聚合物结构单元; h. 多酶级联产生短链酸.

长链仲醇可能是化妆品中的活性成分、油脂化学品中的性能添加剂或天然产物合成中的结构单元以及有机光敏剂，目前无法从天然脂肪酸中获得。先前报道了来自Chlorella variabilis NC64A的脱羧酶(CvFAP)，其能够从脂肪酸合成烷烃或α-取代酸。CvFAP是一种光酶，与现有的化学脱羧途径相比，具有高化学选择性和对官能团高耐受性(不改变底物中的C=C双键和羟基)。

研究人员准备进一步阐明CvFAP的底物范围并将其用于合成官能化烷烃产物，设想从不饱和脂肪酸开始，首先使用脂肪酸水合酶或二醇合酶引入羟基，然后进行CvFAP催化的脱羧(图2)。

图2. 光酶级联将不饱和脂肪酸转化为仲醇方案. a. 脂肪酸水合酶(FAHs)催化将水加入C=C双键，然后由光脱羧酶(CvFAP)介导的脱羧产生长链仲醇; b. 来自构巢曲霉的5, 8-二醇合酶(AnDS)与CvFAP催化产生二醇。

首先研究人员设计了光酶级联反应，在大肠杆菌中分别表达了羧酸脱羧酶CvFAP和油酸水合酶LrOhyA。LrOhyA催化了油酸(1a)的水合作用，然后CvFAP催化中间体脱羧生成9-十七烷醇(1c)。为了确定影响光酶级联反应的因素，当使用LrOhyA的无细胞提取物时，产物产量较低，研究人员认为其稳定性较差，因此决定使用LrOhyA的冻干全细胞。发现在11小时内实现7mM油酸的完全水合，而随后的光酶脱羧明显更快(图3)，证实了LrOhyA是催化级联反应的限制因素。

图3. 将油酸转化为9-十七烷醇的光酶级联反应. a. 反应过程; b. 级联反应的时间曲线. 1a (黑色方块)、1b (绿色圆圈)、1c (蓝色菱形).

接下来进一步研究了光酶级联反应的底物范围。研究人员发现其底物范围广泛，可以将多种不饱和脂肪酸转化为相应的醇(图4)。另外，观察到水合步骤是主要的限制因素，并且相应的不饱和烯烃是主要产物。对相应产物的光学纯度检测发现，在大多数情况下，获得了基本上纯的产物。在这个阶段，研究人员确定了当前反应体系的三个主要局限性：(1)由于亲脂性脂肪酸原料的溶解性差，导致底物负载量差；(2)总反应速率低，特别是水合步骤；(3)需要两个单独的催化剂体系(OhyA和CvFAP)。

图4. 光酶反应体系的初步产物范围.

为了解决溶解度问题，研究人员选择了合适的有机相。鉴于感兴趣的脂肪酸底物通常是从天然甘油三酯中获得，于是使用甘油三油酸酯作为有机相评估了该方法。以溶于甘油三油酸酯中油酸为底物，获得了较高产率的9-十七烷醇。然后，研究人员通过水解酶步骤扩展了级联反应，以甘油三油酸酯作为起始原料，用来自Candida rugosa的脂肪酶(CrLip)催化甘油三油酸酯的水解，LrOhyA介导C=C双键的水合，最后在CvFAP存在下照射反应混合物，生成了9-十七烷醇(图5)。但由于水解速率较快，导致pH降低，脱羧显著减慢，产物产率降低。

图5. 将三油酸甘油酯转化为9-十七烷醇的三酶级联反应

接下来，研究人员通过在大肠杆菌中构建共表达系统来解决低产率问题以及对两种单独催化剂的需求。使用活性更高的来自Stenotrophomonas maltophilia的脂肪酸水合酶(SmOhyA)代替LrOhyA。共表达了SmOhyA和CvFAP，进行油酸的水合/脱羧级联反应，得到9-十七烷醇(图6)，并且观察到更高的油酸水合速率。

图6. 光酶级联. a. 在单一表达宿主中组合SmOhA和CvFAP的光酶级联反应; b. 使用共表达酶转化油酸的时间曲线. 将1a (黑色圆圈)转化为1b (绿色方块)再转化为1c (蓝色菱形)和副产物1f (灰色空心圆圈).

最后，研究人员扩大了水合酶的范围，来自构巢曲霉的5, 8-二醇合酶(AnDS)可以通过两步反应将两个羟基添加到油酸中。因此建立了由两种酶(AnDS和CvFAP)介导的三步级联反应，用于从油酸制备(Z)-十七碳-8-烯-4,7-二醇(1e)。在大肠杆菌中表达二醇合酶和光脱羧酶后，进行了油酸的转化，产生了最终产物(1e)及中间体羟基酸(图7)。

图7. 光酶级联. a. 光酶级联反应将油酸转化为二醇. b. 典型的时间曲线. 1a (黑色圆圈)、1g (绿色空三角形)、1d (绿色三角形)、1e (蓝色方块)、1f (灰色圆圈).

综上所述，研究人员使用脂肪酸水合酶或二醇合酶与脂肪酸脱羧酶的级联，可以从不饱和脂肪酸获得仲脂肪醇。并且，目前该系统的底物范围相当广泛，可以从可再生原料获得相应纯的醇。

整理：WangYC

全文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-020-16099-7

文章题目：

Photobiocatalyticsynthesis of chiral secondary fatty alcohols from renewable unsaturated fattyacids