分享一篇发表在Nature Catalysis上的文章，题目为“In situ lysosomal proteomics enabled by bioorthogonal photocatalytic proximity labelling”，通讯作者是来自北京大学的陈鹏教授和樊新元副研究员。

原位捕获亚细胞蛋白质组学例如溶酶体蛋白质组学，对于了解细胞生理过程至关重要，但其酸性的细胞微环境使得基于酶法的邻近标记技术的应用受限。因此在活细胞中原位研究溶酶体蛋白组具有一定挑战性。本文开发了一种光催化的邻近标记技术用于原位溶酶体蛋白质组学研究。通过使用靶向溶酶体的光催化基团和亚甲基醌探针联用，CAT-Lyso技术能够产生一种活性的中间体物种，从而实现在多种细胞中高效地进行溶酶体蛋白组标记。

使用基于化学邻近标记的蛋白质组学技术，无需对细胞进行工程化改造。作者首先考虑了基于铱的光催化剂，其在活细胞中已有较高的光催化活性，但可能会有线粒体靶向的偏好性，所以最后选择了伊红染料eosin作为光催化剂，其在细胞中的分布没有偏好性，能够模块化地应用到其他亚细胞水平上。

基于光催化的化学邻近标记技术通常有两种策略，一种是生成单线态氧对蛋白质上的芳香性氨基酸进行氧化，后续与带有氨基和biotin的探针进行标记。另一种是基于叠氮苯的保护基团会在eosin光催化系统的作用下，发生光还原脱保护的原理，释放出活性的硫代亚甲基醌中间体，这种中间体能够通过迈克尔加成反应高效标记蛋白质上的亲核氨基酸残基。在模拟溶酶体的体外环境下，作者对两种不同的蛋白质标记系统进行比较，发现使用基于叠氮苯衍生的SF2探针对蛋白质在酸性条件下的标记效率都更高，证实了该体系有足够高的反应性和转化率。

作者进一步使用吗啉基团对eosin修饰后，得到了能够靶向溶酶体的邻近标记探针，之后作者还在Lysocat上连接叔胺基团以保证光催化剂在进入溶酶体被质子化后难以再透膜流出。同时作者使用乙酰基对eosin进行保护能够增加膜通透性，通过confocal对光催化剂的溶酶体靶向进行了验证。随后在细胞实验水平上添加SF2探针后，用绿光进行光催化反应的激活。这一标记信号有光催化剂的浓度依赖性，并且可以被胞内NADH等还原剂的水平所调节，证实了这一过程是氧化还原的机理。该体系在多种细胞系中都有明显标记信号，且标记信号对溶酶体有空间特异性。

基于LC-MS的蛋白质组学分析表明所捕获的蛋白表现出在溶酶体内腔处分布的偏好性。GO分析等则揭示了这些蛋白在膜脂代谢和抗原提呈过程中的作用。作者对于几种此前未被报道在溶酶体中定位的蛋白进行工程化表达，揭示了它们在囊泡运输和亚细胞膜定位上的几种功能，同时还分析了不同细胞类型之间溶酶体蛋白质组学谱的差异。最后作者将这一策略应用到溶酶体蛋白质组的动力学研究，通过对细胞内mTOR通路的调节，辅以CAT-Lyso技术对溶酶体蛋白质组进行分析，揭示了与mTOR通路信号转导相关的蛋白。

总之，作者开发了一种基于光催化的化学邻近标记技术，用于鉴定溶酶体蛋白质组。与基于传统的提纯细胞器进行鉴定的方法而言，所鉴定到的溶酶体特异性的蛋白的特异性显著增强，该方法能够应用于多种样品和细胞类型的研究。

本文作者：SHL

责任编辑：LYC

DOI：10.1038/s41929-025-01298-6

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41929-025-01298-6