分享一篇发表在nature methods上的文章：Global analysis of endogenous protein disorder in cells，通讯作者是来自澳大利亚拉筹伯大学的Yuning Hong教授，该课题组的研究方向包括细胞自噬工具箱，蛋白质内稳态传感器以及生物分析工具。

细胞内蛋白功能依赖于正常折叠形成特定的三维结构，而蛋白折叠质量控制系统的紊乱会导致异常折叠蛋白的积累。此外，真核生物中超过一半的蛋白由天然未折叠蛋白组成，并且在生理条件下含有大量固有的无序区域，这些内在无序蛋白（IDPs）更倾向于与其他分子（如蛋白和RNA）相互作用，并在调节细胞信号通路中发挥作用。这些错误折叠蛋白和IDPs与许多疾病有关，例如阿尔茨海默病，帕金森病，II型糖尿病等。然而，目前仍然缺乏在复杂细胞环境中鉴定异常折叠蛋白的工具。

本文作者提出了一种可以捕获未折叠蛋白的方法，随后可以通过荧光信号读出或基于质谱的蛋白质组学流程进行富集和分析。该方法的核心是设计并合成了一种名为TME的新型化学探针，它由三部分组成：四苯基乙烯（TPE）AIE荧光团、马来酰亚胺（MI）基团和炔基把手。TPE是一种聚集诱导发光基团，MI是一种半胱氨酸反应性基团，在生理条件下可以选择性地与游离半胱氨酸结合。一方面，TPE的体积可以阻止TME分子与埋藏在折叠蛋白内部的半胱氨酸反应，从而增强了对溶剂可及的或构象较为柔性的半胱氨酸的选择性。另一方面，该设计实现了两步荧光激活过程——与硫醇反应以消除MI基团的光致电子转移猝灭效应，以及与蛋白质（但不包括小生物硫醇）的反应，后者为实现分子内运动受限（RIM）效应提供了物理限制。

作者在模型蛋白验证了TME对蛋白质紊乱区域的特异性。例如，DsbA是一种来自大肠杆菌的硫醇氧化酶，包含一个Cys30-Phe-His-Cys33基序，该基序位于α螺旋的N端，其中一个半胱氨酸暴露在表面（C30），另一个隐藏（C33）。TME对未折叠的DsbA的标记比折叠的DsbA更强。作者还把DsbA中隐藏的C33突变为丙氨酸，这样C30所在的二级结构变成了一个柔性环，从而使C30具有更高的灵活性。柔性的增加导致TME对折叠的C33A的反应性增加，与折叠的DsbA相比，荧光增加了四倍。总的来说，TME对位于暴露、灵活和动态环境中的半胱氨酸表现出选择性反应性，这些半胱氨酸是蛋白质紊乱的标志。

更重要的是，通过CuAAC反应，TME可以很容易地与生物素-叠氮偶联，从而可以对TME标记的蛋白进行富集和质谱定量。基于此，作者开发了RUBICON工作流程：首先用TME原位标记待研究的活细胞，提取蛋白质组并进行体外click反应，然后用SA bead富集标记的未折叠蛋白，并使用蛋白质组学方法进行分析。随后作者把RUBICON方法应用于PD患者淋巴细胞的蛋白紊乱分析中，证明该方法是潜在的疾病诊断工具。

综上，本文作者开发了一种活细胞内源性蛋白紊乱的全局分析方法。