天然和工程化DNA聚合酶特异性处理化学功能化核苷酸类似物的能力已成为几种生物技术应用中的一种选择方法，包括当代核酸测序技术、诊断、生物偶联策略和组合核酸选择程序。这些酶还用于访问探针功能化核酸，以研究其结构、识别和治疗潜力。值得注意的是，来自A家族（如KlenTaq）和B家族（如柯达热球菌（KOD））的耐热DNA聚合酶对C5修饰的嘧啶和7-脱氮修饰的嘌呤核苷酸类似物表现出良好的底物耐受性，因此被广泛使用。特别是，通过将杂环偶联或融合到核碱基而衍生的环境敏感荧光核苷酸探针是研究核酸的一类重要生物物理工具。尽管许多结构不同的底物被具有不同特异性和掺入效率的DNA聚合酶处理，但目前可用的数据并不能充分理解使酶能够接受这种非天然核苷酸的潜在机制。因此，预测底物耐受性仍然是一个主要挑战。
图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
有鉴于此，Indian Institute of Science Education and Research的Seergazhi G. Srivatsan课题组展示了水生栖热菌DNA聚合酶（KlenTaq）与C5杂环修饰的环境敏感2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸（dUTP）探针的三元复合物的晶体结构。这些核苷酸包括SedUTP、BFdUTP和FBFdUTP，它们分别在尿嘧啶的C5位携带硒、苯并呋喃和氟苯并呋喃，并表现出高度的构象敏感性。
图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
SedUTP和FBFdUTP用作双app探针，将荧光团与X射线异常散射Se或19F NMR标记结合在一起。研究表明，杂环的大小会影响DNA聚合酶家族A和B在单核苷酸掺入和引物延伸反应中如何掺入这些修饰的核苷酸。值得注意的是，FBFdUTP的反应性能够通过荧光和19F NMR光谱实时监测二元复合物的形成和聚合酶活性。三元配合物的掺入曲线、荧光、19F NMR数据和晶体结构的比较分析突出了酶的可塑性。
图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
最后，这项研究还深入探讨了关键氨基酸（Arg660和Arg587）在调节和处理这些修饰底物中的作用，为下一代核苷酸探针的开发提供了结构基础。
图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
原文标题：Structures of a DNA Polymerase Caught while Incorporating Responsive Dual-Functional Nucleotide Probes
原文作者：Pulak Ghosh, Karin Betz, Cédric Gutfreund, Arindam Pal, Andreas Marx,* and Seergazhi G. Srivatsan*
Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202414319
目前评论：0