本文介绍了一种名为甲基精氨酸靶向嵌合体（MrTAC）的小分子，它可诱导蛋白精氨酸甲基转移酶 1（PRMT1）与靶蛋白接近，从而实现靶蛋白在溶酶体中的降解，为细胞内蛋白质的靶向降解提供了新方法，在基础研究和临床开发中具有潜在应用价值。

小分子降解剂靶向蛋白稳定性是药物发现领域的重要创新，如分子胶和蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs），但利用其他蛋白水解途径开发更多降解剂模式有助于扩大可成药靶点范围。细胞内溶酶体通过自噬途径降解蛋白质，其中微自噬可通过内体分选复合物运输（ESCRT）信号协调将甲基化底物递送至溶酶体。近期研究发现精氨酸甲基化可作为细胞内蛋白质的溶酶体降解信号（MrDegron），I 型PRMT 酶催化蛋白质精氨酸甲基化后可导致其在溶酶体中降解，且 PRMTs 在人体中广泛存在，为开发小分子降解策略提供了可能。

作者首先构建MrTAC系统并验证其诱导蛋白相互作用的能力，开发了能同时结合PRMT1和目标蛋白（POI）结合的的双功能 MrTAC 小分子（以 MrTAC^HaXS8 为例）：PRMT1-HaloTag和POI-SNAP-tag融合蛋白系统（图 1a）。在 HEK293 细胞中，GSK3β-SNAP与空Halo-Tag 共转染后，经不同浓度MrTAC^HaXS8处理，免疫印迹显示，GSK3β-SNAP与空 Halo-Tag 形成的复合物随浓度增加，且总GSK3β水平保持不变，表明MrTAC^HaXS8诱导了蛋白间的相互作用（图 1b）。在稳定表达GSK3β-SNAP和PRMT1-Halo的HEK293细胞中，经不同浓度 MrTAC^HaXS8处理后，GSK3β 能被有效降解，且呈现剂量和时间依赖性（图 1c、d）。活细胞成像显示在 HeLa 细胞中，经 MrTAC^HaXS8处理后 GSK3β阳性细胞比例降低，表明 GSK3β 被降解（图 1e），30 min时GSK3β-SNAP的表达信号降低，表明降解迅速（图 1f）。

图1 MrTAC 诱导 GSK3β 降解

活细胞成像显示，在稳定表达GSK3β-mCherry-Flag和PRMT1-Halo的HEK293 细胞中，MrTAC^HaXS8处理后，GSK3β在处理25 min后与溶酶体重叠，随着时间推移荧光减弱，表明GSK3β被递送至溶酶体降解（图 2a）。邻近连接测定（PLA）检测也证明了这一点（图 2b）。免疫印迹结果显示，溶酶体抑制剂巴弗洛霉素可显著稳定 MrTAC 复合物，而蛋白酶体抑制剂无此效果，表明MrTAC诱导的GSK3β降解发生在溶酶体中（图 2c）。在HEK293细胞中，用针对VPS4A、LAMP2或ATG7的siRNA处理后，转染PRMT1-Halo和GSK3β-SNAP，再经MrTAC^HaXS8处理后的免疫印迹显示，敲低VPS4A可完全挽救 GSK3β 的降解，而敲低 LAMP2 或 ATG7 则无法挽救，表明 MrTAC 通过微自噬降解 GSK3β（图 2d）。共聚焦成像结果显示，敲低VPS4A 后GSK3β不再与溶酶体共定位，进一步证明微自噬在MrTAC降解中的作用（图 2e）。

图2 MrTAC 将 GSK3β 靶向溶酶体进行降解

接着作者通过 PLA 检测到 MrTAC 处理后 GSK3β- SNAP 甲基化增加（图 3a）。从MrTAC处理的细胞中分离复合物进行 LC-MS 分析，也证实了GSK3β在保守精氨酸残基及表面暴露的精氨酸残基96、102和111处发生甲基化，表明 MrTAC 可诱导 GSK3β甲基化（图 3b）。使用PRMT1甲基转移酶活性抑制剂 GSK3368715 或催化失活的 PRMT1突变体，均能阻止 MrTAC 对 GSK3β 的降解，表明甲基化是 MrTAC 降解靶蛋白的前提（图 3c、d）。

图3 MrTAC 诱导的甲基化启动 GSK3β 降解

GSK3β 在细胞生长、胚胎发生和组织再生过程中调节经典 WNT 信号传导，受到刺激时，WNT 配体与膜受体结合，胞质GSK3β被隔离到溶酶体中，从而使β-catenin积累并启动转录活性。基于此，作者评估了人工诱导的 GSK3β 降解是否重现生理 WNT 信号传导。免疫印迹证实 MrTAC^HaXS8能够对 GSK3β-SNAP 持续性降解（图 4a），同时β-catenin的总水平与DMSO 相比稳定（图 4b）。在通过 CRISPR 整合稳定表达GSK3β-SNAP的细胞中，MrTAC^HaXS8处理组显著增加了WNT 靶基因MYC和 BIRC5（图 4c）。此外，在稳定表达PRMT1-Halo 和 GSK3β-SNAP 的 HEK293 细胞中， MrTAC^HaXS8处理组显示出细胞增殖速率显著增加（图 4d）。

MYC是一种核转录因子，调节多种生长过程，是癌症中最常上调的癌基因之一。目前MYC仍然难以被小分子靶向，被认为是不可成药的。作者进一步评估 MYC 是否可以通过 MrTAC 特异性靶向溶酶体，在表达PRMT1-Halo 和 MYC-SNAP的HEK293 细胞中，经不同浓度 MrTAC^HaXS8处理后，免疫印迹结果显示 MrTAC 可诱导MYC 降解，且呈现浓度依赖性（图 4e）。此外，MrTAC处理后细胞密度在7 天后显著降低，表明 MrTAC 降解MYC可抑制细胞增殖。

图4 MrTAC 降解重现 GSK3β 功能丧失表型

图5 MrTAC 降解内源性蛋白靶点

最后，作者分别检测了MrTAC^JQ1 对 BRD4 ，以及MrTAC^SAHA 对 HDAC6 的相关细胞功能。通过定量 PCR 结果发现，MrTAC^JQ1 处理导致 BRD4 下游基因 BCL2 和 BIRC3下调，CDKN1A上调，而 BRD4 转录水平不受影响，这与之前 BRD4 功能丧失的研究结果一致（图 6a）。用 MrTAC^JQ1 处理 PRMT1-Halo 稳定表达的 HEK293 细胞 6 天后细胞增殖率显著降低（图 6b）。通过检测乙酰化微管蛋白水平发现，MrTAC^SAHA 处理组导致乙酰化微管蛋白水平相对于总微管蛋白增加15倍，表明 HDAC6 降解影响了其底物微管蛋白的乙酰化状态（图 6c）。MrTAC^SAHA 处理PRMT-Halo稳定表达的 HEK293 细胞后，细胞存活率显著降低，说明靶向 HDAC6 降解足以影响细胞存活（图 6d）。通过免疫印迹检测发现，在 HDAC6 降解的细胞中，其他HDAC家族成员（如HDAC2 和 HDAC1）的水平不受影响，证实了MrTAC对 HDAC6 降解的选择性（图 6e）。在表达野生型 PRMT1或催化失活 PRMT1（PRMT1^Dead）的稳定细胞系中评估 MrTAC^SAHA 对HDAC6 的降解作用，WB结果以及免疫荧光均显示，在野生型PRMT1细胞中，MrTAC^SAHA处理可降低 HDAC6 水平，而在PRMT1^Dead细胞中，HDAC6 蛋白水平不受影响，进一步证明了甲基化驱动 MrTAC 对活细胞内源性蛋白的靶向降解（图 6f、g）

图6 MrTAC 降解内源性蛋白影响后续功能

综上所述，作者提出了甲基精氨酸靶向嵌合体（MrTAC）这一新型小分子降解剂模式，利用内源性溶酶体途径，通过诱导蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）对底物进行甲基化，实现靶蛋白在溶酶体中的降解，为细胞内蛋白质的靶向降解提供了新的方法和工具。成功将 MrTAC 技术应用于降解通常在蛋白酶体中降解的蛋白质（如 MYC、BRD4 和 HDAC6 等），为针对这些 “不可成药” 靶点的药物研发提供了新的策略和可能性。强调了利用天然但不同于泛素-蛋白酶体途径的溶酶体蛋白水解途径进行靶向蛋白降解的优势，如不受赖氨酸突变影响等，为克服现有降解技术的局限性提供了新的思路，拓展了靶向蛋白降解技术在疾病治疗和基础研究中的应用范围。

文章作者：ZY

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-024-01741-y

责任编辑：WXL