分享一篇发表在Proteomics.上的文章：Combining SDS-PAGE to capillary zone electrophoresis-tandem mass spectrometry for high-resolution top-down proteomics analysis of intact histone proteoforms [1]，文章的通讯作者是密歇根州立大学的孙良亮教授。

作为染色质的基本结构单位，核小体在基因表达调控中起着关键作用，其由H2A、H2B、H3和H4等4种组蛋白组成。两分子的H2A、H2B、H3和H4组成一个组蛋白八聚体核心，DNA分子盘绕在八聚体核心结构的外围就形成一个完整的核小体单元。组蛋白经过翻译后修饰（PTMs），包括甲基化、磷酸化、乙酰化、SUMO化、泛素化、糖基化和ADP核糖基化，来影响染色质结构，以及募集染色质结合蛋白，从而发挥表观遗传调控功能。值得注意的是，组蛋白的PTMs往往不会单独发挥作用，而是通过多种PTMs的协同作用来共同影响表观遗传调控。因此，基于质谱的bottom-up策略很难去捕捉组蛋白共同存在的修饰信息，这就需要借助Top-down策略去解决。

由于组蛋白的变体多样，且存在多种PTMs的组合，因此在质谱检测前对其进行高分辨的分离是至关重要的。近些年，毛细管区带电泳-质谱联用（CZE-MS）开始被逐渐用于组蛋白proteoform的Top-down分析。CZE是根据蛋白的电泳迁移率来对它们进行分离。一些PTMs可以显著改变蛋白的电荷特性，如乙酰化和磷酸化，从而改变其电泳迁移率，实现不同proteoform间的分离。这说明CZE-MS可为组蛋白proteoform的表征提供了一种具有潜在价值的技术。由于组蛋白proteoform的高度复杂性，在进行质谱分析前对其进行多维度的分离是极其必要的。SDS-PAGE是蛋白质组学研究中常用的技术，可以依据分子量的大小实现蛋白质在凝胶中的分离。PEPPI-MS（Passively Eluting Proteins from Polyacrylamide gels as Intact species for MS）是一种对从聚丙烯酰胺凝胶中被动洗脱出的蛋白进行质谱分析的方法。该技术首先通过SDS-PAGE分离完整的蛋白质，接着对目标条带进行染色和切割，并通过研磨提取蛋白，从而获得完整的蛋白质样本以进行Top-down质谱分析。尽管PEPPI-MS方法已成功应用于多种复杂样本体系，但其在组蛋白Top-down分析中尚未得到系统评估。因此，作者希望在本工作中将SDS-PAGE与CZE-MS相结合，希望多维度的分离能够对组蛋白体系进行高分辨分离，从而更好用于组蛋白proteoform的Top-down表征分析。

作者首先考察了两种不同的样品在线预富集方法：场放大样品堆叠法和动态pH连接法，选择小牛胸腺组蛋白提取物作为研究对象。基于动态pH连接的CZE-MS是复杂蛋白质组Top-down分析的常用工具。在动态pH连接法中，蛋白样品被溶解在一个比BGE的pH高很多的缓冲液中，蛋白会在CZE分离之前在pH边界处浓缩富集。这里测试了两种不同的动态pH连接溶解buffer，包括50mM醋酸铵（pH=9）和50mM醋酸铵（pH=6.5），以及测试了两种不同的场放大样品堆叠溶解buffer，分别是水和30%乙腈。如图1A所示，四种CZE分离条件下的分离谱图相似，组蛋白H1与四种核心组蛋白可以很好分离开，但这四种核心组蛋白仅能做到部分分离。样品溶解在50mM醋酸铵（pH=9）中可以获得较低的电泳迁移率，且H4、H2A和H2B的分离也较好，所以后续实验选择50mM醋酸铵（pH=9）作为样品溶解buffer。

作者也进一步探究了HCD归一化碰撞能量（NCE）对于组蛋白proteoform鉴定的影响。这里总共比较了六种不同的NCE能量，包括12，14，16，18，20和24，以及一种stepped能量（14，17和20）。如图1B所示，除了NCE为24时鉴定到的proteoform数目偏低，其余能量鉴定到的数目并无明显区别，这可能是因为24的能量过高，蛋白过于碎裂。图1C展示的是不同能量下鉴定到的proteoform分布。E值代表二级谱图匹配到的离子数目的非线性转换，离子数目越多，E值越小，-log10E值越高，可信度也越高。当能量太低或太高时，比如12，20和24，它的-log10E值比14，16，18和step的低，表明能量太低不利于组蛋白的碎裂，而能量太高又会导致其碎裂过度。

图1.样品溶解buffer和HCD能量的优化。（A）不同样品溶解buffer的分离谱图；（B~C）不同碰撞能量下鉴定到的组蛋白proteoform的数目和E值分布。

  

图2.PEPPI分离过程的优化。（A）上图是组蛋白提取后的凝胶图像，下图是用不同试剂提取后的蛋白溶液图像；（B）H2A和H3经脱色和不经脱色的电泳谱图；（C）SDS-PAGE分离组蛋白或其对应的馏分；（D）直接使用SDS从凝胶中提取蛋白与经过SDS提取后再纯化的蛋白回收率的比较；（E）每个组分的CZE-MS分离检测谱图；（F）每个馏分中组蛋白proteoform前体离子分子量的分布。

图3.SDS-PAGE与CZE-MS相结合方法的重现性。（A）两组相同组蛋白样品的CZE-MS谱图；（B）两个重复相同馏分间的proteoform重叠情况；（C）两个重复相同馏分间的proteoform强度的相关性。

最后，作者也举例展示了该分析方法在描绘组蛋白proteoform分离特征图中的应用。组蛋白H4在84号蛋氨酸上有一个氧化修饰位点，其氧化和非氧化形式的proteoform在CZE中的迁移特征是不一样的，如图4A所示。这些proteoform都带有1个二甲基化修饰，并且也带有不同数量的乙酰化修饰。当H4带有更多乙酰化修饰时，其电泳迁移速度较慢，这是因为乙酰化会减少蛋白正电荷的带电量。该结果表明CZE适合用于分离带有能显著改变蛋白电荷特性的PTMs的组蛋白。图4B（proteoform-1）和图4C（proteoform-2）展示的是组蛋白H2B1N的两个proteoform。Proteoform-2在14号丝氨酸处发生的磷酸化通常被认为是凋亡细胞的凋亡特异性标志物，而相邻15号位赖氨酸上的乙酰化则是非凋亡细胞的特征。上述两个位点的修饰没有在同一个proteoform中存在也表明H2B上的PTMs是相互作用的，15号位赖氨酸的去乙酰化是14号位丝氨酸磷酸化的必要条件。此外，作者也注意到组蛋白proteoform的碎裂覆盖率受到HCD的限制，这给PTMs位点的定位带来一定挑战。后续可以考虑将更高效的碎裂方式（如UVPD和ECD）与本分析方法相结合，来实现对组蛋白proteoform更为深入的Top-down表征。

图4.鉴定到的组蛋白proteoform例子。（A）组蛋白H4的proteoform分离特征图；（B~C）组蛋白H2B1N两个proteoform的序列碎裂谱图；（D）图B中proteoform-1的二级碎裂谱图。

总的来说，作者结合SDS-PAGE和CZE-MS，开发了一种用于组蛋白proteoform的Top-down分析方法，该方法具有高的重现性和分辨能力。此外，后续研究还可以通过优化SDS-PAGE分离度、换用更长的分离毛细管、优化BGE等措施来进一步提高分辨率。作者希望该方法能够成为复杂生物样品Top-down分析的有力工具。

撰稿：陈昌明

编辑：李惠琳

文章引用：Combining SDS-PAGE to capillary zone electrophoresis-tandem mass spectrometry for high-resolution top-down proteomics analysis of intact histone proteoforms.