分享一篇发表在Science Advance上的文章，题目为A ubiquitin-specific, proximity-based labeling approach for the identification of ubiquitin ligase substrates，通讯作者共两位，分别为来自欧洲分子生物学实验室（EMBL）的Sagar Bhogaraju研究员，和来自慕尼黑大学的Christian Behrends教授。Bhogaraju课题组主要研究泛素化修饰的分子机制，Behrends课题组则研究蛋白稳态。
蛋白质泛素化修饰参与了几乎所有细胞过程的动态调控。在E1、E2和E3的酶促级联反应下，76 aa的泛素蛋白（Ub）通过异肽键与底物赖氨酸共价连接。在人体中，已知有2种E1泛素激活酶、~40种E2泛素偶联酶以及>600种E3泛素连接酶共同实现了泛素化修饰的精细调控。基于结构的同源性，E3泛素连接酶可以分为RING、U-box、HECT、RBR多种蛋白家族。由于E3连接酶是泛素化修饰过程的决定性参与者，因此揭示E3泛素连接酶的底物谱对于深入了解其细胞和生理作用至关重要。在这里，研究人员开发了一种方法，可以直接在细胞中选择性地、稳健地标记特定E3 Ub连接酶的底物。基于对UbcH5A~Ub-RNF4、HECT NEDD4L~Ub这两个E2~Ub-E3复合物的结构进行观察，研究人员注意到E3泛素连接酶含催化结构域的蛋白末端与Ub的N末端具有保守的空间邻近性，并且以相同的朝向暴露在溶剂中。作者设想，若将大肠杆菌生物素连接酶（BirA）表达在E3泛素连接酶的催化末端，同时在Ub的N末端表达BirA的“接受肽”（AP），当E2~Ub-E3复合物形成时，两者具有空间与朝向的匹配性，BirA将能够催化Ub上的AP序列发生生物素化。随后，生物素化的AP-Ub 被转移到底物蛋白上，从而可以使用链霉亲和素富集以及蛋白质质谱技术对底物蛋白进行系统鉴定。研究人员首先在RING家族E3泛素连接酶RAD18上对上述概念进行验证。已知在紫外线诱导的DNA损伤中，RAD18与E2泛素偶联酶RAD6共同介导增殖细胞核抗原（PCNA）的单泛素化，从而引发跨损伤DNA合成过程。在UV处理后，可观察到蛋白质组中生物素化水平显著升高，同时，定量蛋白质组学分析也将PCNA鉴定为唯一显著上调的修饰蛋白。上述结果均证实本文设计在鉴定E3连接酶底物上的可信性。随后，研究人员对标记体系进行优化。首先，考虑到AP与BirA的亲和力较高，在不依赖于E2~Ub-E3复合物的存在下，游离AP-Ub即可发生直接的生物素化，最终带来较高的标记背景。在此，作者证明AP截断体能够显著降低标记背景，并最终选用(-2)AP-Ub进行后续实验。泛素化是一种可逆共价修饰，可以被去泛素化酶（DUB）擦除。DUB的活性将导致生物素化的(-2)AP-Ub被循环利用，对底物鉴定的特异性和效率造成不利影响。通过使用广谱DUB抑制剂PR619，研究人员提高了PCNA底物鉴定的置信度，同时得到了更多的潜在RAD18底物。研究人员将本文方法与BioID进行了比较。当仅在RAD18上融合表达BirA突变体时，基于相同的实验条件能够得到高达320个富集的潜在相互作用蛋白，其GO富集分析分类则集中在剪接体、转录因子，表明RAD18处于复杂的蛋白相互作用网络中。此外，基于BioID技术所富集的蛋白与本文鉴定的潜在底物只有1个蛋白的重叠，进一步突出了本文方法在鉴定E3连接酶底物上的优越性。为展示该方法的普适性，研究人员也将该体系应用于其他E3泛素连接酶中。作者揭示了短时NF-κB处理下，RING家族E3连接酶TRAF6的底物谱，并对含U-box结构域E3连接酶CHIP在蛋白质质量过程中的底物谱进行研究与验证。原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adp3000文章引用：10.1126/sciadv.adp3000
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