分享一篇发表在JACS上的文章“In Situ Biofilm Affinity-Based Protein Profiling Identifies the Streptococcal Hydrolase GbpB as the Target of a Carolacton-Inspired Chemical Probe”，通讯作者是来自美国埃默里大学化学系的William M. Wuest，他的主要研究方向是抗菌天然产物及其作用机制。
天然产物是抗生素药物设计的重要前体，这些分子作为化学支架为化学家提供了合成灵感，可以利用其结构来开发新型抗菌剂和化学探针。Carolacton 是由 Sorangium cellulosum 生物合成的天然产物，已被证明会影响变形链球菌的碳利用、细胞壁生物合成、氨基酸代谢和生物膜形成，对肺炎链球菌也存在抑菌效果，说明该分子可能在链球菌中存在保守的互作靶标。在作者实验室过去的工作中，通过分流全合成（Diverted Total Synthesis, DTS）的方法，他们简化了Carolacton，获得了其类似物（A2），实验证实其具有比天然分子更好的生长抑制和抗生物膜活性，但其作用的生物靶点尚不清楚。因此在本文中，作者以Carolacton的类似物A2为化学支架，在末端羧基上酰胺化衍生，合成了带有光交联基团双吖丙啶和富集基团炔基的探针（A2-PP）。在标记实验时，作者设计了两组条件，分别在微生物生物膜（Biofilm）合成早期以及生物膜成熟时期进行探针标记，紫外照射后收集生物膜，裂解获取蛋白，用罗丹明-叠氮或生物素-叠氮即可富集用于荧光胶或质谱分析。SDS-PAGE的结果显示，在变形链球菌生物膜发育期进行标记时富集到的蛋白信号更为显著，这与抑制实验的表型一致。随后，作者设置浓度梯度，发现标记浓度在1-5 μM时较好。随后，作者分析了质谱数据，与DMSO对照组相比进行无标定量分析，要求靶标在1 μM A2-PP处理时要有标记，且浓度提升到5μM A2-PP标记时表现出剂量依赖性富集。最终筛选出了3个靶标，其中GbpB的剂量依赖性富集效果最明显。作者通过过表达和体外纯化实验证实了GbpB与A2-PP和A2的结合。且由于研究者对于GbpB在细菌生长中的作用知之甚少，因此作者通过序列分析将目光转向了其同系物——来自肺炎链球菌的PcsB，该蛋白表征结果较多且具有已解析的晶体结构。作者证实了A2分子与PcsB也具有较明显的结合作用。通过将PcsB晶体结构与GbpB在AlphaFold2中的预测结构比对，发现它们确实具有高度同源性。因此，作者对接计算预测了PcsB与A2的相互作用位点，发现A2主要与保守的 C 端 CHAP（Cysteine, histidine-dependent, amidohydrolase/peptidase）结构域结合，也是该结构域报道的第一个小分子结合剂。总的来说，本文揭示了天然产物Carolacton衍生的化合物 A2 的蛋白质靶标，并通过对其同源蛋白的分析揭示了蛋白-小分子结合位点，对于抗菌分子A2的作用机制研究具有重要意义。文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c06658原文引用：DOI: 10.1021/jacs.4c06658
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