J. Am. Chem. Soc. | 基于原位生物膜亲和力的蛋白质分析鉴定Carolacton靶标蛋白

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分享一篇发表在JACS上的文章“In Situ Biofilm Affinity-Based Protein Profiling Identifies the Streptococcal Hydrolase GbpB as the Target of a Carolacton-Inspired Chemical Probe”,通讯作者是来自美国埃默里大学化学系的William M. Wuest,他的主要研究方向是抗菌天然产物及其作用机制。


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天然产物是抗生素药物设计的重要前体,这些分子作为化学支架为化学家提供了合成灵感,可以利用其结构来开发新型抗菌剂和化学探针。Carolacton 是由 Sorangium cellulosum 生物合成的天然产物,已被证明会影响变形链球菌的碳利用、细胞壁生物合成、氨基酸代谢和生物膜形成,对肺炎链球菌也存在抑菌效果,说明该分子可能在链球菌中存在保守的互作靶标。在作者实验室过去的工作中,通过分流全合成(Diverted Total Synthesis, DTS)的方法,他们简化了Carolacton,获得了其类似物(A2),实验证实其具有比天然分子更好的生长抑制和抗生物膜活性,但其作用的生物靶点尚不清楚。
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因此在本文中,作者以Carolacton的类似物A2为化学支架,在末端羧基上酰胺化衍生,合成了带有光交联基团双吖丙啶和富集基团炔基的探针(A2-PP)。在标记实验时,作者设计了两组条件,分别在微生物生物膜(Biofilm)合成早期以及生物膜成熟时期进行探针标记,紫外照射后收集生物膜,裂解获取蛋白,用罗丹明-叠氮或生物素-叠氮即可富集用于荧光胶或质谱分析。SDS-PAGE的结果显示,在变形链球菌生物膜发育期进行标记时富集到的蛋白信号更为显著,这与抑制实验的表型一致。随后,作者设置浓度梯度,发现标记浓度在1-5 μM时较好。随后,作者分析了质谱数据,与DMSO对照组相比进行无标定量分析,要求靶标在1 μM A2-PP处理时要有标记,且浓度提升到5μM A2-PP标记时表现出剂量依赖性富集。最终筛选出了3个靶标,其中GbpB的剂量依赖性富集效果最明显。
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作者通过过表达和体外纯化实验证实了GbpB与A2-PP和A2的结合。且由于研究者对于GbpB在细菌生长中的作用知之甚少,因此作者通过序列分析将目光转向了其同系物——来自肺炎链球菌的PcsB,该蛋白表征结果较多且具有已解析的晶体结构。作者证实了A2分子与PcsB也具有较明显的结合作用。通过将PcsB晶体结构与GbpB在AlphaFold2中的预测结构比对,发现它们确实具有高度同源性。因此,作者对接计算预测了PcsB与A2的相互作用位点,发现A2主要与保守的 C 端 CHAP(Cysteine, histidine-dependent, amidohydrolase/peptidase)结构域结合,也是该结构域报道的第一个小分子结合剂。
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总的来说,本文揭示了天然产物Carolacton衍生的化合物 A2 的蛋白质靶标,并通过对其同源蛋白的分析揭示了蛋白-小分子结合位点,对于抗菌分子A2的作用机制研究具有重要意义。
本文作者:FTY
责任编辑:ZJ
文章链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c06658
原文引用:DOI: 10.1021/jacs.4c06658




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