褪黑素是一种由松果体分泌的激素，能够调节人体的生理节律和睡眠。目前褪黑素在全球的需求量日益增加，其工业化生产主要以化学法合成为主，但存在原料成本不易获得、污染环境、反应路线长等缺点。作为替代方案，绿色高效的全酶法催化合成褪黑素受到广泛关注。在酶法合成褪黑素的过程中，芳烷基胺N-乙酰转移酶（Arylalkylamine N-acetyltransferase，AANAT）的活性较低，从而会限制褪黑素合成的产量。作为褪黑素生物合成的关键限速酶，AANAT催化底物5-羟色胺（5-hydroxytryptamine）生成N-乙酰-5-羟色胺（N-acetyl-5-hydroxytryptamine）（图1）。因此通过酶工程手段提高AANAT催化5-羟色胺的活性，具有重要的研究价值和科学意义。

本研究以一种家牛来源（Bos taurus）的N-乙酰转移酶BtAANAT为模板开展进化分析获得系列新颖AANAT（图2a），并经实验测试发现欧亚野猪来源（Sus scrofa）的SsAANAT全细胞催化活性最高（图2b）。以野生型SsAANAT为模板，经过四轮理性迭代突变，成功获得了一个三组合优势突变体M3（SsAANAT-P58S/T62E/V138I）（图2c）。与野生型SsAANAT相比，最优突变体M3的全细胞催化活性从50%提高到99%。此外，在热稳定性没有明显损失的同时（T_m > 45 °C），M3的催化效率（k_cat/K_m）也提高了2倍。为了测试AANAT催化5-羟色胺生成N-乙酰-5-羟色胺的工业应用潜力，本研究测试了10 mL体系中，全细胞催化50 mM底物5-羟色胺的放大反应。结果显示，在30小时内其转化率可达到99%（图2d）。

此外，本研究还利用分子动力学模拟揭示了优势突变体M3（SsAANAT-P58S/T62E/V138I）活性提高的原因，其中58和62位点的突变通过改变环区的灵活性来影响酶的催化活性，138位点对辅因子结合的能量贡献较大。因此，突变体M3通过改变与底物5-羟色胺和辅因子AcCoA新形成或增强的相互作用，从而提高了催化活性。

综上，该工作为通过蛋白质工程手段提高AANAT的活性奠定了基础，同时也拓宽了乙酰化吲哚化合物的生物催化应用工具箱，为进一步设计同类型AANATs作为褪黑素生物合成的催化剂提供了有益的启示。