Anal. Chem. | 电子激活解离和碰撞诱导解离糖肽碎片优化糖蛋白组学

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推荐一篇发表在Analytical Chemistry上的文章,题目为“Electron-Activated Dissociation and Collision-Induced Dissociation Glycopeptide Fragmentation for Improved Glycoproteomics”,通讯作者是来自澳大利亚昆士兰大学的Benjamin L. Schulz教授,主要研究方向是蛋白质糖基化。



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串联质谱与液相色谱法联用(LC-MS/MS)已是鉴定和定量蛋白质及其翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs)的通用工具。蛋白质糖基化关系到蛋白质稳定性和多种生物学功能,但目前对蛋白位点特异性糖基化的全面表征仍然存在挑战性。碰撞诱导解离(Collision-induced dissociation, CID)是LC-MS/MS工作流程中最常用的碎片化方法,但是不稳定修饰的缺失使得CID不适合用于表征位点特异性的糖基化。基于电子的解离方法可以作为CID的替代,电子激活解离(Electron-activated dissociation, EAD)是其中一种。EAD能保留完整的糖肽片段以进行明确的位点定位,但与CID相比,碎裂时间较长和效率较低。这篇文章中,作者使用了ZenoTOF 7600 SCIEX来比较各种碎片化技术的性能,以分析哺乳动物O-和N-糖肽的复杂混合物,发现CID方法能鉴定出最多的糖肽,谱图质量更高,但EAD在糖基化位点定位方面提供了更高的置信度。于是他们用CID方法补充EAD (EAciD)增加了糖肽鉴定的数量和质量,同时保持了定位的可信度。
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CID模式导致分子内最弱的共价键优先断裂,因此,断裂优先发生在糖苷键而不是肽段的酰胺键上。因此,糖肽CID谱含有丰富的关于聚糖的信息,与相对较少的关于肽的信息。尽管如此,CID允许较快的扫描速度,但缺乏肽片段离子使得糖基化位点定位困难。EAD技术利用电子产生自由基,诱导较强的酰胺键断裂,使肽主链优先被碎裂,因此能更好地对修饰进行定位,而几乎不产生糖苷键的碎裂结果。然而,EAD碎裂方法利用电子,会改变片段的带电状态,容易产生中性片段而使检测强度降低,EAD方法对具有较大的负电荷聚糖或具有较低电荷状态的前体糖肽的鉴定效率较低。EAD碎裂方法所需的时间也比CID时间长。
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因此,在这篇文章中,作者利用人类A549细胞中获取的糖肽样本,首先对EAD碎裂的参数进行了优化,包括射频(radio frequency, RF)、电子束电流、电子动能(kinetic energy, KE)和碎裂时间,最终选择KE为8 eV,碎裂时间为20 ms,RF为200 Da,电子束电流为5000 nA,以获得高质量的MS/MS谱。接下来,作者对四种碎裂方法进行了分析:CID,EAD以及两种结合了CID以及EAD的EAciD方法。EAciD方法具有两种不同水平的CID补充,均基于由前体离子m/z和电荷状态确定的滚动CE方程。第一个EAciD方法(默认EAciD)使用标准滚动CE方程。第二种方法(低能EAciD)使用梯度降低50%的调整的滚动CE方程。他们对每种方法的糖肽谱匹配进行了主成分分析,发现每种方法具有鲁棒且独特的聚类。作者发现,使用CID和默认EAciD方法,O-糖肽鉴定的相对比例较高,虽然EAD和低能量EAciD方法鉴定数目较少,但与CID相比,它们并没有偏向于特定类别的糖肽鉴定。与CID和默认EAciD相比,EAD和低能EAciD方法倾向于识别具有较高电荷态的糖肽。作者比较了糖肽鉴定的分布及其相关的谱图得分,发现默认的EAciD模式具有较高的谱图质量以及鉴定数目。Byonic提供的“delta mod”分数是衡量肽修饰定位置信度的一个指标,分数> 10.0表示修饰被正确定位的可能性很高。作者测试了CID, EAD和EAciD方法的性能,发现所有基于EAD的方法都优于CID。
总之, 作者利用EAciD组合CID和EAD方法提供了信息高度丰富的糖肽MS/MS谱,增加了糖肽鉴定的数量和质量,同时保持了定位的可信度。
本文作者:ZCL
责任编辑:ZF
原文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c01450
原文引用:DOI: 10.1021/acs.analchem.4c01450






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