分享一篇近期发表在Nature Communications上的文章，题目为“Location-agnostic site-specific protein bioconjugation via Baylis Hillman adducts”。文章的通讯作者为印度博帕尔科学教育与研究所的Dimpy Kalia。
蛋白质N-末端半胱氨酸（N-Cys）独特的反应性对选择性蛋白质标记具有重要意义。此前，作者报道了衍生的Baylis Hillman加合反应与1,2-氨基硫醇之间的快速选择性反应，以形成双杂环支架，并将其用于体外和活细胞条件下稳定的蛋白质生物偶联。作者将这种蛋白质生物偶联技术称为Baylis Hillman orchestrated protein aminothiol labelling （BHoPAL）。此外，作者还报道了一种基于硫辛酸连接酶的技术，用于在蛋白质内任意位点引入1,2-氨基硫醇部分，使 BHoPAL技术应用不局限于N-Cys，从而与位置无关。将这种方法与BHoPAL联用，生成了双标记的蛋白质生物偶联物，即在单个蛋白质分子的两个不同特定位点上附加了不同的标记（图1）。
图1. 用于蛋白质中1,2-氨基硫醇化学选择性生物偶联的BHoPAL（Baylis Hillman orchestrated protein aminothiol labelling）策略。
靛红衍生的 Baylis Hillman（IBH）反应已被用作合成复杂天然产物的支架、医药中间体和临床药品的研究，尽管对IBH进行了广泛的研究，但它们与1,2-氨基硫醇的反应性尚未报道。作者设想IBH中有两个适当定位的离去基团，一个α-乙酸基团和一个β-氰基团，将与1,2-氨基硫醇进行两次连续的加成-消除反应，以生成6元环状加合物（图2）。该反应将涉及初始硫醇添加，然后消除乙酸盐以生成中间体 B，然后进行分子内氮杂-迈克尔加成，然后消除氰基形成2，由于分子内2中的烯烃将被锁定在Z构象中，使该反应具有高度的Z选择性（图 2）。作者合成了N-乙酰的IBH加合物1并在碱性条件在室温下，在质子有机溶剂和非质子有机溶剂以及水溶液中反应，验证了上述假设。
图2. 通过IBH加合物介导的1,2-氨基硫醇衍生化合成C=C连接的双杂环。
首先，作者用N -酰基IBH加合物1A和1B在不同pH条件下用等摩尔量的半胱胺·盐酸处理，在高pH条件下反应的更快(图3a)。用烷基取代N -酰基会减慢与N -甲基加合物1c的反应。接下来，作者研究了从n -乙酰半胱氨酸(NAC)开始的20种蛋白质原氨基酸对1,2氨基硫醇片段的选择性，均具有不错的产率(图3b)， N-甲基加合物1C也得到了类似的结果。基于半胱氨酸和1A在pH值为6、7、7.5和8的水溶液中的反应的紫外光谱的动力学分析，计算出他们的二级速率常数 (图3c)。建立了BHoPAL对1,2-氨基硫醇的优异化学选择性。
图3. 水溶液条件下N -酰基/烷基IBH加合物与半胱氨酸的快速定量偶联。
接下来，作者使用BHoPAL标记蛋白质的N-Cys残基。构建了三种N-Cys模型蛋白的，增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和mCherry，通过重组生产这些蛋白，将它们融合到烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶底物肽(ENLYFQC序列)的N端，并进行TEV蛋白酶裂解(图4)。用等量的N -乙酰基IBH加合物1A、1D和1E在pH 6.5的磷酸钠缓冲液中处理所得的N-Cys蛋白，通过ESI-MS分析，所有9种蛋白偶联物均可得到，产率高达99%(图4)。这些结果确定了对蛋白质内部半胱氨酸的N-半胱氨酸的选择性。作者发现蛋白质生物偶联物是稳定的，并保留了未修饰的前体蛋白的结构和功能特性。这些结果表明，在温和的生物相容性条件下，BHoPAL在低试剂浓度下快速定量进行，而不会破坏蛋白质结构和功能以形成稳定的蛋白质偶联物。
图4. 通过BHoPAL标记含N-Cys 的蛋白质。
将N-Cys附加的MBP引入含有eGFP、肌红蛋白(Mb)和溶菌酶(Lyso)的蛋白质混合物中，然后荧光N-丹酰IBH加合物1 G处理3小时(图5a)，只有MBP产生荧光标记（图 5b）通过用N-炔基IBH加合物1D处理混合物，然后用丹酰叠氮化物(DanN3)进行Cu(I)催化叠氮化物-炔环加成(CuAAC)反应。只产生标记的MBP(图5b)。为了探索BHoPAL在细胞应用中的潜力，作者利用它对细胞表面融合蛋白EGFR-eGFP进行荧光标记，eGFP在其N端含有Cys残基(图5c)。绿色通道eGFP荧光成像证实了该N-Cys EGFR-eGFP融合蛋白在HEK293细胞中的瞬时表达和质膜定位(图5d)。用N-炔基IBH加合物1D在室温下处理这些细胞30分钟，然后使用红色荧光叠氮化物Cy5-N3进行CuAAC反应, 并在质膜上只对表达N - Cys EGFR-eGFP蛋白的细胞进行荧光处理。此外， eGFP未转染细胞(图5d)没有呈现红色，这表明红色荧光是BHoPAL介导的蛋白质标记的特定结果，而不是因为Cy5-N3染料与其他细胞成分之间的非特异性相互作用。这些实验表明BHoPAL不仅在体外选择性地对1,2-氨基硫醇进行偶联, 而且也适合于活细胞蛋白的生物偶联应用。
图5. 在多组分、体外和活细胞条件下通过 BHoPAL 对N-Cys 蛋白进行选择性荧光标记。
在蛋白质的N端以外的位置引入半胱氨酸相对困难，成为1,2-氨基硫醇介导的蛋白质生物偶联的主要限制。将1,2-氨基硫醇片段引入蛋白质上任何所需位点的技术上简单有效的方法将极大地促进BHoPAL和其他基于1,2-氨基硫醇标记的生物偶联方法的广泛使用。作者开发一种化学酶方法来实现这一目标，该方法基于LAP标签技术，需要使用细菌硫辛酸连接酶(LplA)，将噻唑烷基团引入任何所需的蛋白质位点。LplA催化其识别序列的赖氨酸的ε-氨基、LAP标签(GFEIDKVWYDLDA)和硫辛酸(LA)的羧基之间形成异肽键(图6a)，并已被用于将生物正交功能基团引入蛋白质。作者设想噻唑烷之间的结构相似性（图 6a），LA的二硫烷环将允许基于噻唑烷的LA（TzLA）类似物作为LplA的底物，从而能够将1,2-氨基硫醇部分（以噻唑保护的形式）引入含有LAP标签的蛋白质中。作者使用了LplA的W37V变体，它比野生型酶更有效地催化非天然LA类似物与LAP标签蛋白的连接。对TzLA类似物C2-C7Tz与LplAW37V结合的分子对接研究， C4和C5Tz的产率与天然LA相似 (图6b)。延长TzLA类似物的碳链长度导致更好地与酶结合，这与先前报道的其他LA类似物的趋势一致。为了在实验上验证这些对接预测，合成了C2-C7Tz类似物，并在重组产生的LplAW37V存在下，将它们与LAP肽(250µM)孵育，并使用HPLC监测连接反应(图6c, d)。与对接分析的预测一致，较长链长的类似物是更好的底物，C7Tz在1小时内以92%的产率形成其LAP共轭物，而C4Tz和C5Tz的连接产率分别为31%和39%(图6d)。尽管提高酶和类似物浓度，孵育时间长达10小时，但未观察到C2Tz和C3Tz与LAP肽的连接（图6d)。C4Tz和C5Tz只有在酶和类似物浓度升高的情况下，经过10小时的孵育才能提高产率(图6d)。相比之下，将C7Tz置于条件C下，仅需5分钟就获得所需产物。将这种基于LPLA的技术与BHoPAL结合使用，提供了一种简便且高产的方法，可以在任何所需的位点上生成标记的蛋白质。采用上述优化条件在蛋白质上进行LPLA介导的LAP-TzLA偶联(图6e)。结果表明，将这种基于LPLA的技术与BHoPAL结合使用，提供了一种简便、高产的方法，可以在任意位点上生成标记的蛋白质。
图6. BHoPAL在蛋白质的任何位点掺入1,2-氨基硫醇基团。
最后，作者基于LAP标签的方法将1,2-氨基硫醇与N端半胱氨酸安装在上述蛋白质的内部位置，通过BHoPAL在蛋白质的不同位置安装两个标签提供了一种方便的策略。制作了一个在其c端附加LAP标签的N-Cys-MBP变体，然后使用的C7Tz类似物生成一个含有两个1,2-氨基硫醇片段的蛋白质变体(N-Cys-C7AT)，进行伴随BHoPAL的蛋白双修饰（图7）。通过在不同的反应条件下处理N-Cys-C7AT，研究了BHoPAL在蛋白质中安装两种不同标签的范围。通过BHoPAL标记N-Cys-MBP-LAP的N端，用一种IBH加合试剂(1D)对其进行处理，然后使用我们的C7Tz类似物在所得1D-MBP -LAP偶联物的LAP标签上安装另一个1,2-氨基硫醇片段，以生成1D- c7at偶联物。随后用1E处理得到所需的蛋白质偶联物，1D-C7-1E在蛋白质的两个不同位置附加了两个不同的标记 (图7b)。通过BHoPAL对C7-1D和1D-C7-1E偶联物以及MBP- LAP蛋白(未标记蛋白)与直链糖-琼脂糖树脂进行孵卵，评估了MBP单标记和双标记对其与配体直链淀粉结合能力的影响。这些结果表明，将BHoPAL与LPLA的技术结合使用，为生产双标记蛋白质偶联物提供了一种强大、直接和高产的方法。
图7. 通过BHoPAL对蛋白质进行双重标记。
综上所述，作者揭示了IBH加合物与1,2-氨基硫醇之间的高的Z选择性，在生理条件下快速形成含C=C的双杂环支架。利用这种化学方法开发了BHoPAL平台，该平台能够对蛋白质N-Cys残基的1,2-氨基硫醇部分进行定量和位点特异性标记。此外，还报道了一种基于LplA酶的化学酶技术，该技术能够在感兴趣的蛋白质上的任何所需位点引入1,2-氨基硫醇基团，从而使基于1,2-氨基硫醇的生物偶联方法(如BHoPAL)与位置无关。
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