分享一篇ACS Central Science上的文章：A Translation-Independent Directed Evolution Strategy to Engineer Aminoacyl-tRNA Synthetases，通讯作者是波士顿学院的Abhishek Chatterjee教授，他们课题组主要开发非天然氨基酸插入技术用于新型生物疗法。本文作者开发了名为START的策略，实现了无需表达蛋白即可筛选指定非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶(aaRS)。
非天然氨基酸插入技术为精确调控蛋白功能开拓了全新的化学空间，在非天然氨基酸插入体系的筛选过程中，目前的难点在于有一些非天然氨基酸难以被天然的核糖体接纳。虽然可以通过编辑核糖体蛋白的方式来实现插入，但是如果要对aaRS和核糖体一起筛选将会引入巨大的工作量。如果能够首先定向进化可用的aaRS，再对核糖体进行编辑将会大幅简化这一过程，因此本文作者希望开发一种无需经过后续的核糖体翻译过程即可对aaRS进行定向进化，使其对特定的非天然氨基酸进行识别的方法。作者的策略是对氨酰tRNA使用高碘酸进行处理，由于没有连接酰基的tRNA会被氧化为邻二醛，因此只有成功连接了酰基的tRNA能够保留3’-OH。在对酰基进行碱性水解后，含有3‘-OH的tRNA可以与后续加入的寡核苷酸序列进行配对并被进一步延伸，这部分被成功延伸的tRNA可以通过非变性胶上的位移来与未延伸的tRNA进行区分，再用于后续的测序。为了能够在测序之后确定有活性的aaRS携带了哪种突变，作者在tRNA的反义密码子区域引入了10个随机的碱基序列作为条形码，这些条形码可以用于编码10^6量级的aaRS突变体，在对筛选出的tRNA进行测序后可以通过条形码的序列来指认有活性的aaRS上携带的突变。作者以N-Boc-赖氨酸和m-碘代苯丙氨酸为例进行了筛选，他们在maPylRS口袋内的三个氨基酸位点(Leu125, Asn166, Val168)处引入了所有可能的20种氨基酸的密码子库，相当于32768种不同的突变体。通过筛选在加入非天然氨基酸前后富集程度较高的突变体，作者发现N-Boc-赖氨酸的确富集在了WT蛋白上，这与WT蛋白本身能够连接N-Boc-赖氨酸吻合。m-碘代苯丙氨酸对应的突变体经过验证的确能够成功将其插入GFP，并在质谱上得到了验证。最后作者还展示了START技术有可能实现对非α-氨基酸的筛选，包括α-羟基酸等。总之，这篇文章开发了一种无需在核糖体翻译过程即可对aaRS突变体进行筛选的策略，避免了核糖体对一些非天然氨基酸识别问题对筛选带来的困难。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.3c01557文章引用：https://doi.org/10.1021/acscentsci.3c01557
我的微信
关注我了解更多内容
{list_comment type="article" format="Y-m-d H:i:s"}
no cache
Processed in 0.641127 Second.
目前评论：0