介绍的是最近在JACS上报道的一篇标题为 “Acetylation Targeting Chimera Enables Acetylation of the Tumor Suppressor p53” 的文章。该文的通讯作者是纽约西奈山伊坎医学院蒂施癌症研究所肿瘤科学系的Jian Jin研究员。在本文中，作者团队开发了一种三元嵌合体分子，能够特异性地使肿瘤抑制因子p53 Y200C突变体发生乙酰化反应，最终产生抗肿瘤活性。

    蛋白质降解靶向嵌合体(PROTAC)是一种异双功能分子，能够分别结合细胞内待降解的目标蛋白(POI)和泛素-蛋白酶体系统中的E3泛素连接酶，使目标蛋白多聚泛素化随后被降解。多种PROTAC作为治疗癌症的新治疗方式已进入临床发展阶段。泛素化实质上是一种动态翻译后修饰，因此，受到PROTAC这类异双功能分子的启发，开发出了许多新的化学诱导接近(CIP)技术，通过诱导特异性的蛋白质翻译后修饰来重新编程内源性生物系统，以治疗一些通常意义上具有挑战性的疾病。包括去泛素化靶向嵌合体(DUBTAC)、磷酸化靶向嵌合体(PHICS)，然而，迄今为止，还没有一种能够诱导蛋白乙酰化的嵌合体出现。

    赖氨酸乙酰化是一种动态的翻译后修饰，由乙酰辅酶A通过乙酰转移酶转移到赖氨酸的ε-氨基侧链上，从而调节不同的蛋白质性质。对于一些肿瘤抑制因子如PTEN和p53而言，其赖氨酸乙酰化能够使其响应DNA损伤，并调节其与MDM2复合物的稳定性，是其发挥调节细胞周期、促进肿瘤细胞生长抑制和凋亡作用的重要因素，同时也能诱导细胞发生铁死亡。因此，特异性诱导p53的乙酰化具有极大的肿瘤治疗潜力。

    在本文中，作者开发出了一种异双功能小分子，被称作乙酰化靶向嵌合体(AceTAC)，通过劫持乙酰转移酶直接诱导POI的乙酰化，而不需要任何基因操作。他们使用p53 Y220C突变体作为研究对象，该突变体因为酪氨酸的突变丧失了部分DNA结合活性从而导致不稳定，是多种癌症中的热点突变。该团队发现，通过靶向乙酰化p53 Y220C突变体，能够起到相比小分子稳定剂更强效的肿瘤抑制活性。

    首先，他们对目标AceTAC分子进行了理性设计。p53 Y220C的突变给p53带来了一个可结合的“腔”，一些化合物已经被证明能够通过结合该腔来稳定p53 Y220C突变体。作者在其中一种分子PK9323的溶剂暴露区域引入一个二级胺，使其能够与另一部分配体分子相连。对于另一部分，该团队选择了组蛋白乙酰转移酶p300/CBP来诱导p53 Y220C的乙酰化。化合物33拥有较高的p300/CBP结合活性，因此该团队使用不同长度的PEG连接子连接两个配体部分，构建了AceTAC分子1-4。通过Western Blot他们发现化合物3-4能部分诱导p21蛋白的表达，但效率不是很高。因此，为了进一步提升与p53 Y220C的结合作用，他们改造了PK9323部分的甲基化部分，设计了化合物5-9。最终，这些化合物在H1229细胞系(携带p53 Y200C突变)上展现出了更高的p21诱导活性以及p53 K382ac乙酰化能力。(图1)

图1. p53蛋白的乙酰化靶向嵌合体的分子设计及其乙酰化能力初步研究

    接下来，他们进一步优化了上述化合物中乙酰化表现最优的化合物7，以图发现一个效率更高的靶向乙酰化嵌合体。通过将PK9323的噻唑环改为甲基噻吩环，进一步提升了其亲和力，所得化合物被命名为MS78，其有着比化合物7更高的p53 K382ac诱导活性，EC₅₀值大大降低。并且只能够在p53 Y220C突变细胞系中乙酰化p53，若没有p53存在的细胞系则不能乙酰化。此外，他们还通过抑制剂或siRNA沉默的方法证明了MS78介导的p53乙酰化是依赖于目标乙酰转移酶p300/CBP的。高浓度的化合物33也能够竞争性地使MS78失活。(图2)

图2. MS78的分子结构以及其特异性乙酰化p53 Y220C突变体的能力和机制验证

    随后，作者团队验证了肿瘤细胞系中p53 Y220C乙酰化所引起的抗增殖活性。他们分别在不携带p53的H1229和p53 Y220C突变体的H1229细胞系上进行了实验，发现相比起PK9323和化合物33，MS78在p53 Y220C细胞系上以浓度依赖的方式呈现出了显著的抗增殖能力，且该抗增殖活性与p53 K382ac程度明显相关。siRNA沉默实验则进一步证明了这种抗增殖活性是p300/CBP乙酰转移酶依赖的。除此之外，他们还在p53 wt的U2-OS细胞系上证明了该AceTAC对野生型p53没有抗增殖能力。 (图3)

图3. MS78乙酰化p53 Y220C突变后所引发的抗增殖能力

    最后，作者深入研究了p53 Y220C乙酰化所引起的信号通路变化，以阐明p53乙酰化所导致的功能与p53稳定剂分子的区别。通过RT-PCR和RNA-seq等实验表征MS78和PK9323处理后细胞基因水平上的差别。分析所得数据可以发现，PK9323的作用主要诱导了CDKN1A(p21蛋白)和BTG1等基因的表达以及CDK1、CDK4等基因的抑制，从而诱导细胞周期停滞。而MS78的作用主要在于激活TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)通路中的一系列相关基因，从而使肿瘤细胞发生凋亡。此外，在MS78处理后还观察到了部分与细胞铁死亡相关基因的表达。(图4)

图4. p53 Y220C的特异性乙酰化和小分子稳定剂诱导肿瘤抑制过程中的分子机制研究

    综上所述，该工作报道了一种能够使目标蛋白特异性乙酰化的嵌合体分子AceTAC，通过高效快速地诱导肿瘤抑制因子p53 Y220C突变体的乙酰化，增加了p53肿瘤抑制的活性，且只在Y220C突变的细胞系上有作用。此外，他们还证明了这种依赖于乙酰化的功能激活与普通的p53稳定剂相比有着完全不同的作用机制。

作者：DYH  审校：HYH

DOI: 10.1021/jacs.3c04640

Link: https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.3c04640