分享一篇发表在Bioconjugate Chemistry上的文章，题为Site-Specific Chemical Modification of a Cytokine Mimic for Small Molecule-Based Tumor Targeting。文章的通讯作者是来自瑞士联邦理工学院的Sebastian Oehler教授。
由于细胞因子的多效性以及细胞外毒性，在癌症免疫疗法中需要设计靶向递送策略。这通常依赖于抗体或抗体片段，然而，融合蛋白的分子量较大，可能表现出较低的组织穿透性。对肿瘤相关抗原具有高亲和力的小分子配体为细胞因子的靶向递送提供了有前景的选择方案。另一方面，David Baker等人报道了一种通过计算设计改造的白细胞介素-2及白细胞介素-5（IL-2/5）的模拟物Neo-2/15，能够选择性地结合IL-2Rβγ，但不结合IL-2Rα，这一受体选择性提高了小鼠癌症模型的治疗活性。同时，Neo-2/15与PD-L1靶向抗体的融合进一步增加了抗肿瘤效果。由此作者假设，将Neo-2/15与小分子靶向部分化学偶联能够提供一种具有肿瘤选择性的可行方案。 作者使用乙酰唑胺的衍生物（AAZ+）作为靶向部分，它在纳摩尔级别能够与临床上经验证的肾细胞癌标志物碳酸酐酶IX（CAIX）相互作用。如图1所示，小分子靶向部分通过固相合成，随后通过点击化学反应，偶联到寡聚乙二醇linker上，引入醛基官能团。另外，作者使用CHO细胞表达Neo-2/15，其N端带有His标签，同时标签上带有一个靠近半胱氨酸的肠激酶裂解位点。 蛋白的偶联过程通过一锅法完成。在37℃的还原条件（9 mM DTT）下，将Neo-2/15与AAZ+及肠激酶孵育过夜。通过LC-MS以及SDS-PAGE对偶联物进行分析。如图2所示，反应混合物中残留部分未被修饰的酶切后Neo-2/15，能够通过阴离子交换层析分离，获得高纯度偶联物AAZ+-Neo-2/15。 随后，如图3A所示，作者使用小鼠毒性T细胞系CTLL-2进行了增殖实验，AAZ+-Neo-2/15与His-Neo-2/15均表现出高效力，EC50分别为(18±7) pM以及(41±10)pM。另外，如图3B，使用Biacore检测与CAIX结合亲和力的结果也显示，AAZ+-Neo-2/15具有结合亲和力（KD=(2.1±0.2)nM），而His-Neo-2/15不能够结合。 由于噻唑烷在生理条件下能够水解，作者在37℃下测试了偶联物在PBS及小鼠血清中的稳定性。通过SDS-PAGE的分析，在PBS中，偶联物的半衰期在96小时以上，在血清中，半衰期超过48小时。图3. 偶联物中细胞因子的生物活性及小分子配体的结合活性评价 由于AAZ+-Neo-2/15在血清中的稳定性，作者向SK-RC-52荷瘤小鼠中注射了荧光标记的AAZ+-Neo-2/15及阳性对照（仅小分子靶向部分AAZ+）以及阴性对照（His-Neo-2/15），探究肿瘤靶向能力。由图4可见，注射后6小时，从小鼠分离出肿瘤及健康器官，进行荧光分析。AAZ+-Neo-2/15及AAZ+成功定位于肿瘤。 本文中，作者通过一锅法，制备了具有高纯度及高产率的AAZ+-Neo-2/15。通过形成噻唑烷的方式，偶联物具有位点特异性的化学修饰。偶联物在血清中保留了细胞因子部分的生物活性以及小分子部分的抗原结合活性，稳定性较好。DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.3c00194Link: https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.3c00194
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