分享一篇2023年发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，题目是“An ROS-Responsive Donor That Self-Reports Its H2S Delivery by Forming a Benzoxazole-Based Fluorophore”。文章的通讯作者为美国北卡罗来纳州温斯顿-塞勒姆威克森林大学化学系的John C. Lukesh III。
硫化氢(H2S)是一种气体递质是内源性信号分子，类似于激素和神经递质，在人体内引起重要的生理和病理生理效应，这些效应源于它们对特定细胞靶点的作用，并且与许多疾病相关。将H2S输送到生物系统的传统方法包括使用硫化物盐（NaHS和Na2S）作为缓冲液。然而，它们的使用会导致大量的效果，难以模仿H2S的天然酶生产，并且通常会导致有毒的副作用。Lawesson试剂的水溶性衍生物GYY4137是第一个为此目的开发的合成H2S供体。虽然GYY4137在几种疾病模型中显示出有希望的治疗潜力，但它的低效率和对H2S输送缺乏时空控制，导致人们寻找更有效、刺激反应性更强的供体，这些供体的激活可以更容易地调整到特定的生物条件。为了协助这些工作，作者最近开发了一种新的通用设计策略，通过利用分子内亲核辅助，通过精确的生物刺激启动，提高硫酰胺基给体释放H2S的选择性和效率（方案1）。
方案1：提高硫胺素供体硫化氢释放速率、效率和选择性的一般设计策略。
虽然之前有文献报道过ROS激活的H2S供体，但这些化合物通常会经过1,6消除，首先释放羰基硫化物或COS（一种生物活性气体），然后通过碳酸酐酶进一步转化为H2S。此外，该反应途径导致产生1,4-醌类化合物，这是一种高毒性的促氧化剂，可能会抵消H2S的抗氧化作用。在这项研究中，作者利用这种创新的化学方法，通过同时合成苯并恶唑基荧光团来创建ROS激活的、自我报告的供体，该供体与H2S释放相一致（方案2）。
方案2：活性氧活化H2S供体。
使用硼酸酯作为过氧化氢的已知和高度生物正交的反应物，研究开始于化合物1的合成。与方案1中描述的一般设计策略相比，方案1中的亲核试剂是苯酚，被硼酸酯保护以抑制其亲核性。然而，在H2O2存在的情况下，设想硼酸酯氧化会揭示亲核酚，然后将其环化到硫酰胺上，以协助H2S的贡献。在验证这一假设之前，最初想评估1在10倍PBS中在37°C下的稳定性。1进行了连续水解分解，在第一个小时内释放出约40 μM的H2S（收率为80%）。对照化合物2的稳定性，它缺少硼酸酯。与1不同，化合物2表现出所期望的芳基硫酰胺的水解稳定性，在整个2.5小时的孵育期内没有观察到硫化物释放的证据（图1）。
图1：(a) (b) Lewis酸辅助水解分子的机制，促进H2S在生理pH下在缓冲液中传递。 (c) 在10× PBS (pH 7.4)条件下，37℃下H2S从1 (50 μM)中释放的时间过程。
接下来作者通过对芳基取代基进行结构修饰，探索了电子和空间效应对这一水解途径的影响(R，图2a)。使用亚甲基蓝测定法监测缓冲液中H2S的初始释放速率（图2b）。正如预期的那样，随着吸电子吡啶基3和对三氟甲基取代基4的引入，相对于1的水解速率分别提高了8倍和3倍以上，观察到一个明显的趋势。相反，也正如预期的那样，化合物5具有一个供电子的对甲氧基取代基，被发现更稳定，水解速度比1慢1.4倍。此外，虽然相对于1,2-萘基6似乎对水解速率影响不大。但观察后发现，邻取代供体（7、8和9）在缓冲液中似乎是稳定的，没有H2S释放的证据。作者推测这是由于硫酰胺附近的空间效应增加或芳基环和硫酰胺之间的偶联断裂，这明显抑制了水解途径。为了验证邻位取代芳基硫酰胺的Lewis酸辅助水解完全关闭，延长了亚甲蓝测定的反应时间。如图2c所示，在整个时间过程中，具有正取代甲基取代基的7似乎是完全稳定的，在整个150分钟的孵育过程中没有硫化物释放的证据。
图2： (a) Lewis酸辅助水解缓冲液供体库。(b)在10倍PBS (pH 7.4)条件下，37℃下H2S从供体中释放的时间过程。释放的H2S用亚甲蓝分光光度法(670 nm)定量。(c)延长时间过程以确认7在10倍PBS (pH7.4, 37℃)中的稳定性。
通过邻位取代提高水解稳定性后，作者接下来想要评估这些衍生物是否能像最初预测的那样，在ROS存在下通过硼酸酯氧化环化途径释放H2S。为了验证假设，作者将7、8和9 （50 μM）暴露于100 μM的H2O2中，并使用亚甲基蓝测定在不同时间点释放的硫化物量（图3）。观察到过氧化氢的加入，实际上刺激了释放H2S。为了进行比较，在相同的条件下检查了1和2（图3）。虽然对照化合物2似乎是稳定的，但发现1在暴露于过氧化物时也会提供H2S（图3）。有趣的是，虽然7、8和9在缓冲液中完全稳定，但在H2O2存在下，它们释放H2S的速度明显快于1。这表明，虽然它们的水解稳定性得到了增强，但邻位取代基的引入可能会提高氧化/环化途径的反应活性。
图3：在10× PBS (pH 7.4, 37°C)条件下，在H2O2 (100 μM)存在下，1、2、7、8、9 (50 μM)和对照化合物2 (50 μM)中H2S的释放时间过程。
通过简单的结构修改，调整供体的空间和电子效应，可以很容易地控制导致H2S供体的两种不同途径。例如，虽然含有苯基环的供体1在H2O2存在下通过两种竞争途径进行（方案3），但引入一个吸电子基团(即吡啶基代替苯基)增强了硫酰胺的亲电性，使其几乎完全通过水解反应。相反，邻位取代给体由于位位效应完全关闭水解，通过氧化/环化途径完全释放H2S。
方案3：H2O2存在下1 (a)和7 (b)释放H2S的推测机制。
从作者最初的文库中，发现8和9衍生的苯并恶唑副产物是弱荧光的，考虑到它们π共轭的程度，这并不奇怪，在9的情况下，由于放置了一个供电子的甲氧基，有轻微的推拉效应。为了增强随后的副产物的荧光特性，选择用更强给电子的二甲胺取代9上的甲氧基取代基(图4a)。作者确定，通过监测DMA-Benzoxa-Fluor随时间在λmax处的荧光强度，可以很容易地测量反应过程（图4b）。从校准曲线可以确定，在5小时的孵育期后，DMA-Benzoxa-Fluor的产率大于90%。重要的是，还验证了QH642的初始响应率与H2O2浓度成正比（图4C）。因此，除了监测反应过程外，DMA-Benzoxa-Fluor的清洁形成赋予QH642作为H2O2传感器的能力，不仅可以用于检测甚至量化存在的H2O2的量。
图4：(a)QH642与H2O2反应产生一种新型苯并恶唑基荧光团。(b) QH642 (10 μM)在PBS (pH 7.4)和H2O2 (100 μM)存在下的荧光发射随时间变化。(c) 随着H2O2浓度的增加，QH642(10 μM)荧光强度的初始速率变化。
为了进一步验证QH642中H2S的传递，作者再次采用比色亚甲基蓝法（图5a）。在没有过氧化氢的情况下，注意到QH642在任何可测量的程度上都无法输送H2S，这证实了其在2.5 h孵育期间的水解稳定性。然而，随着H2O2的加入，在670 nm处的吸光度稳定增加，证实了H2S从供体QH642中释放出来。为了确保添加谷胱甘肽本身不会导致任何H2S的贡献，对QH642进行了各种还原剂、亲核试剂和其他硫化物释放氧化剂的筛选，证实了QH642具有优异的稳定性（图5b）。
图5：(a)在10× PBS (pH 7.4, 37°C)、无H2O2 (100 μM)和有H2O2(100 μM)条件下，QH642 (50 μM)中H2S释放的时间过程。(b) QH642在10倍PBS (pH 7.4)和37°C下多种生物分析物存在下的选择性。
基于制作者的全部实验结果和对照研究，作者认为QH642与H2O2的反应机制可能如下(方案4):加入缓冲液后，QH642迅速形成Lewis酸活化配合物(QH642b)，该配合物对水解稳定，但在H2O2存在下氧化形成QH642e。然后，这个复合物经历路易斯酸辅助环化，在释放H2S的过程中干净地提供DMA-Benzoxa-Fluor。
方案4: H2O2存在下QH642释放H2S的可能的机制。
然后作者通过共聚焦荧光显微镜验证了DMA-Benzoxa-Fluor (40 μM)可以在细胞内观察到（图6a）。然而，当QH642与H2O2 (500 μM)共培养时，观察到强烈的蓝色荧光(图6d)，证实了其对细胞ROS的响应性。作为额外的对照，HeLa细胞也被QH642a(酰胺类似物，40 μM)和H2O2 (500 μM)共处理，但正如预期的那样，没有观察到荧光细胞(图6c)。
图6：(a)用DMA-Benzoxa-Fluor (40 μM)染色的活HeLa细胞。(b)成像前用QH642 (40 μM)处理活HeLa细胞1小时。(c)成像前用QH642a和H2O2 (500 μM)处理活HeLa细胞1 h。(d)成像前用QH642 (40 μM)和H2O2 (500 μM)处理活HeLa细胞1 h。
综上所述，芳基硫胺与邻位取代硼酸酯的结合为H2S的贡献提供了一种新颖的、高度模块化的平台。利用这种化学方法，发现它们通过两种不同的途径释放H2S: Lewis酸促进的水解和ROS触发的环化。作何确定水解途径可以通过空间和电子效应来调节，体积更小，吸电子取代基提供最快的路易斯酸促进水解速率。相反，引入邻位取代基可以使水解途径完全不可操作，这迫使该供体类只能通过氧化/环化途径进行，该途径直接选择性地传递H2S以响应ROS。
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