分享一篇发表在Nature Communications上的文章：Spatiotemporal and direct capturing global substrates of lysine-modifying enzymes in living cells，通讯作者是中科院上海药物所的陈小华和谭敏佳教授，前者课题组主要进行蛋白相互作用和蛋白稳态研究，后者主要研究基于蛋白质组学技术的蛋白质翻译后修饰调控和药物精准干预。这篇文章作者结合非天然氨基酸技术开发了一种能够对活细胞内对特定赖氨酸翻译后修饰酶的底物进行空间分辨捕获的策略。
蛋白上的翻译后修饰有很大一部分都是由酶催化产生，许多翻译后修饰酶都不仅仅修饰单一底物，而是有着很广泛的修饰底物范围。此前报道的研究某一修饰酶底物谱的方法包括蛋白质/多肽阵列，AP-MS，或是通过基因敲除结合对翻译后修饰进行富集鉴定的手段来进行。其中前两种手段受限于裂解液的环境，无法真实地反映细胞内的蛋白质状态，最后一种手段虽然目前应用最为广泛，但由于许多翻译后修饰往往有多条生成路径，对特定修饰酶的敲除无法排除在该过程中通过其它途径对翻译后修饰的间接影响。因此，本文作者希望通过在修饰酶上引入遗传编码的光控交联基团来实现对修饰酶底物的全局性共价捕获。作者以赖氨酸上修饰为研究对象，计划通过遗传密码子扩展技术在修饰酶的活性口袋附近插入邻硝基苄醇衍生物(o-NBAK)，从而可以在光照后产生能够与赖氨酸特异性发生反应的亚硝酰苯甲醛，进而与修饰酶底物的赖氨酸残基发生共价交联，最终实现对修饰酶底物的鉴定。为了验证这一策略的可行性，作者首先对大肠杆菌的乙酰化酶PatZ催化结构域的同源建模结构进行分析，最终选取了靠近活性中心的L813位来插入o-NBAK。作者随后将表达了PatZ-L813o-NBAK的大肠杆菌进行UV照射，经过His-tag纯化后再对蛋白进行SDS-PAGE和银染分析，他们的确在更高分子量处看到了新的条带，说明有底物蛋白被成功交联到。经过对条带进行切胶质谱检测，他们鉴定到了28个潜在的修饰酶底物，包括一个已知的底物RpoA。对AcrA纯蛋白体系的验证成功鉴定到了交联肽，证实修饰发生在AcrA的K131位。后续的功能研究表明K131的乙酰化修饰能够阻止AcrA-AcrB-AcrZ-TolC外排泵的形成，进而抑制细菌对抗生素的耐受。最后作者将这一策略应用到了细菌中的乙酰转移酶YiaC，硫辛酰化修饰酶LplA，酰基转移酶TmcA，YjaB以及人源的酰基转移酶Tip60，GCN5，分别实现了对相应底物的组学分析。总之，这篇文章通过在修饰酶的活性口袋附近插入可光激活交联的非天然氨基酸，实现了对活细胞内修饰酶底物的全局性鉴定。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-45765-3文章引用：https://doi.org/10.1038/s41467-024-45765-3
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