分享一篇发表在Science上的文章，文章题目为“Characterization and heterologous reconstitution of Taxus biosynthetic enzymes leading to baccatin III”，本文通讯作者为中国农业科学院农业基因组研究所阎建斌教授以及北京大学化生系的雷晓光教授。阎老师的研究方向为植物次生代谢的调控研究，雷老师研究方向为天然产物的化学生物学。

紫杉醇是最富有代表性的天然产物成药分子。目前用于生产紫杉醇的策略是化学半合成。该方法从植物细胞培养物或红豆杉的原始树木中分离baccatin III，随后通过化学转化为紫杉醇。但这样的方法也难以满足市场的需求，随着合成生物学的发展，以绿色和可持续的方式生产紫杉醇是非常重要的课题。紫杉醇的生物合成反应步骤可分为三个关键过程，包括从底物香叶基焦磷酸(GGPP)形成紫杉烷骨架，通过C4和C20双键的环氧化生物合成baccatin III，以及将phenylisoserine链连接到baccatin III的C13位置生成紫杉醇。C13侧链的形成及其与baccatin III结合生成紫杉醇的研究已经得到了很好阐述。然而，形成baccatin III的几个基本步骤仍然未知，特别是环氧丁烷的形成和C9的氧化。因此，紫杉醇生物合成的上游和下游步骤无法连接，迄今为止缺乏完整的紫杉醇生物合成途径。

作者之前的研究表明，CYP725A亚家族只存在于红豆杉属，该亚家族包含所有参与紫杉醇生物合成的加氧酶。作者首先根据系统发育分析将CYP725A亚家族的基因分为三组(I、II和III组)，并通过农杆菌介导的转化在烟叶中同时表达每组中所有基因。当农杆菌浸润后第4天外源基因表达达到较高水平时，作者将底物注射到进行浸润的相应叶区。反应一天后，用甲醇提取叶片代谢物，用液相色谱-质谱(LC-MS)分析。作者发现Chr9_74725878(TOT1)可以催化环氧丁烷的形成。作者随后根据生化实验，推测了TOT1底物1生成环氧丁环的机制。作者发现TOT1是一种双功能加氧酶，它直接将烯烃部分转化为环氧化物和环氧丁烷。然而，TOT1不能作为异构酶将环氧环转化为环氧丁烷。因此，环氧化物不是形成环氧丁烷的必要中间体。

随后作者利用了乙酰基紫杉烷取代底物，还鉴定了在baccatin III生物合成中缺失的C-9氧化酶(T9αH1)。在鉴定出baccatin III合成的两个必需基因(TOT1和T9αH)后，作者尝试将这两个新基因与其他已知参与baccatin III生物合成的基因(TXS、T5αH、T13αH、2α h、T7βH、TAT和TBT)共表达，以确定是否可以人工重建烟草baccatin III的生物合成途径。结果表明，当T9αH和TOT1与baccatin III生物合成途径的7个已知基因共表达时，可以成功检测到baccatin III。作者最后认为，由于可能存在分叉途径，烟草中baccatin III的总体产量较低(~50 ng/g DW)。未来的研究将集中于阐明这9种酶的具体催化顺序，并找到速率优化的决定步骤。