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分享一篇摘自Nature Chemistry上的“Proteolysis-targeting chimeras with reduced off-targets”。泊马度胺是一种在PROTACs中广泛使用的E3连接酶招募剂,它可以独立降解其他蛋白,包括zinc-fnger(ZF)蛋白,在健康和疾病中发挥重要作用。这种靶向降解阻碍了基于泊马度胺的PROTACs的治疗适用性,需要开发PROTAC设计规则来最小化靶向降解。本文作者开发了一个高通量平台,可以筛选基于泊马度胺的PROTACs诱导的几种ZF蛋白的靶降解。
蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC)中,泊马利度胺经常被附加到靶蛋白结合物上,以产生一个分子嵌合体,诱导靶蛋白和CRBN连接酶复合物之间的接近。与分子胶一样,这种接近诱导导致靶蛋白泛素化和降解。然而,这些PROTACs中的泊马利度胺部分也可能泛素化和降解ZF蛋白,这些蛋白在正常发育和疾病进展中发挥关键的生物学功能。泊马度胺以不依赖于PROTAC的方式降解其他蛋白质的能力引起了人们对这些化合物脱靶泛素化和降解的不稳定性的担忧,因此,迫切需要一种稳健、敏感和高通量的方法来确定这种PROTACs的脱靶降解。
图1
为了分析泊马度胺及其类似物对ZF降解倾向,作者首先开发了一种自动成像分析方法(图1a)。对于这个平台,作者选择了11个ZF蛋白的23个氨基酸ZF,这些蛋白能够被泊马度胺降解,3个没有降解。将把这些ZF碎片插入到一个慢病毒降解表达载体中(cilantro 2),来比较ZF标记的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)与未标记的mCherry的荧光情况。
通过此实验,作者分析了9个已报道的PROTACs的脱靶活性,它们具有不同的泊马度胺末端和连接子长度的出口载体。观察到几乎所有9个PROTACs都有许多ZF结构域的降解(图1b)。值得注意的是,具有共同出口载体的PROTACs,如芳酰胺、芳基醚、芳基碳和芳基酰胺,通常具有类似于波马利度胺的更大的ZF降解能力。
图2
为了验证这一成像平台,作者使用已报道的NanoBRET检测方法测定了PROTACs与CRBN和脱靶ZFP91形成的三元配合物的相对稳定性(图2a)。在这里,PROTACs诱导荧光素酶(附加到ZFP91)和荧光团(通过HaloTag结构域附加到CRBN)之间的生物发光共振能量转移(BRET)。生成了一个稳定表达zfp91-纳米荧光素酶(NLuc)融合的细胞系,并用halotag融合的CRBN(HT-CRBN)转染这些细胞,然后用荧光团(即NanoBRET-618配体)和PROTACs处理。观察到PROTACs的BRET信号,表明CRBN、脱靶ZFP91和PROTACs之间形成了三元复合物(图2b)。由于三元配合物的形成不能保证靶标降解,作者也使用免疫印迹和全局蛋白质组学分析证实了内源性ZF蛋白的脱靶降解,例如已报道的PROTACs MS4078(ALK PROTAC)和dTAG-13(FKBP12F36V PROTAC,图2d)。
总之,作者开发并验证了一种基于图像的高通量脱靶谱分析平台,用于系统评估PROTAC介导的ZF蛋白脱靶降解,该蛋白在生物学和疾病进展中发挥着关键作用。利用这个平台来确定设计基于波马度胺的PROTACs的规则,通过设计和测试波马度胺类似物库来减少ZF蛋白的脱靶降解,这项研究的发现为开发新的和更安全的PROTACs提供了机会,并改进现有的PROTACs。
本文作者:FJY
责任编辑:FJY
原文链接:https://doi.org/10.1038/s41557-023-01379-8
DOI:10.1038/s41557-023-01379-8
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