分享一篇近期发表在ACS Omega上的研究进展，题为Construction of Peptide-Lipoic Acid Cationic Polymers with Redox Responsiveness and Low Toxicity for Gene Delivery。这篇文章的通讯作者是四川大学的Hui Zhao和Kang Wang。
基因疗法是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病从而达到治疗目的，并且目前已成为最有前途的癌症治疗方法。然而，作为一种带负电荷的大分子，核酸很难自行进入细胞以及逃逸核酸酶降解，因此需要基因载体协助递送，主要分为病毒载体和非病毒载体两类。其中，部分病毒载体虽然具有转导效率高、表达稳定以及细胞靶向特异性等优点，但是仍然面临生产成本高、基因载量低和免疫原性高等问题，这严重限制了其发展。相比之下，以阳离子聚合物为代表的非病毒载体因免疫原性低、可重复递送和结构灵活易改性等特点而备受关注，包括聚乙烯亚胺(PEI)、聚氨酯(PAMAM)和聚丙烯亚胺(PPI)。然而，这些聚合物中大多数表现出高细胞毒性、极低的转染效率和高血液凝固风险，严重制约了阳离子聚合物基因载体的临床应用。 已有研究表明，提高基因载体的生物相容性可以非常有效地降低其细胞毒性，使其成为一种更安全有效的递送方法。目前，带正电的氨基酸，如精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)表现出巨大的蛋白质转运和药物递送潜力。另外，硫辛酸及其聚合物表现出良好的生物安全性和刺激响应性，同样在药物和基因递送方面展现出广阔的应用前景。本文中，作者构建了一种基于多肽-硫辛酸的阳离子聚合物，其中的二硫键可以响应肿瘤细胞中的谷胱甘肽(GSH)实现快速降解并释放所携带的基因(图1)。此外，作者还通过调整侧链序列赋予聚合物不同功能，从而制备出多种聚合物功能材料。图1. 多肽-硫辛酸聚合物制备以及形成纳米聚集体的示意图 如图2所示，为获得低毒且易于降解释放基因的多肽-硫辛酸阳离子聚合物，作者通过固相合成方法得到了多肽修饰硫辛酸单体M1-M3，进而成功制备了结构可调的阳离子聚合物P1-P3。其中，引入Lys是为使聚合物带正电荷，引入甘氨酸(Gly)是为降低聚合物分子的空间位阻以提高其对不同空间构象的适应性，而引入亮氨酸(Leu)则是为阻断侧链的结构规律性从而防止聚合物直接在水溶液中自组装。图2. 多肽修饰的硫辛酸单体结构式与聚合-降解示意图 阳离子聚合物有效结合和释放核酸的能力对于基因递送非常重要。作者通过琼脂糖凝胶电泳(AGE)评估了聚合物的基因结合能力。如图3A-C所示，结果表明，P1捕获DNA的能力有限，而当w/w(聚合物/DNA质量比)达到16/1，P2和P3都成功捕获了具有不同碱基对的基因，且P3的捕获效果更好。而将复合物再暴露于10 mM谷胱甘肽(GSH)溶液中后，AGE测试结果表明GSH在一定程度上增强了P2和P3释放DNA的能力(图2D-I)。总的来说，P1的DNA负载能力最差，P3最强但是释放能力一般，而P2则相对在DNA负载与释放方面都表现出优异结果，是一种很有前途的基因递送载体。图3. 聚合物-DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳测试(A-F)以及不同GSH浓度下复合物的DNA释放曲线(G-I) 随后，作者通过DLS测定了多肽-硫辛酸聚合物与pAAV-CAG-GFP质粒(pDNA)复合物的粒径分布与zeta电位。结果表明，P2与质粒形成的复合物粒径分布最均匀(图4A)，并且在w/w=24/1时，P2与质粒形成的复合物带正电，与AGE结果一致(图4B)。作者还通过透射电子显微镜(TEM)观察了复合物的形貌，发现在w/w=24/1时，P2与质粒能够在去离子水中浓缩形成规则的球状纳米颗粒而不聚集，表明它们具有良好的稳定性，这十分有益于基因递送过程(图4C)。
图4. 聚合物与质粒形成复合物的相关表征与结构示意图
作者还通过CCK-8测定法评估了不同聚合物-pDNA复合物在不同细胞系中的细胞毒性。结果表明P1和P2的细胞毒性最低，且远低于相同浓度下的PEI(图5)。图5. 不同细胞系暴露于不同聚合物-pDNA复合物的活性数据(A)293T细胞; (B)CHO-K1细胞; (C)Hela细胞 最后，作者通过基因转染实验来验证了质粒能否在细胞中成功释放与表达。如图6所示，相比于P1和P3，P2与质粒形成的复合物(w/w=24/1)转染良好，整个过程中可以观察到绿色荧光蛋白形成。 综上所述，作者通过多肽修饰硫辛酸制备了三种多肽-硫辛酸单体及其相应聚合物。这些聚合物可以通过侧链带正电荷的基团与带负电荷的基因组装在一起形成规则的球形纳米颗粒，且这种复合物具有低细胞毒性。这些特性赋予了多肽-硫辛酸阳离子聚合物理想的基因递送特性，使其有望被广泛用作基因治疗的基因递送平台。DOI: 10.1021/acsomega.3c07194Link: https://doi.org/10.1021/acsomega.3c07194
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