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分享的是一篇发表在JACS上的文章，文章题目为“Bifunctional Small Molecules That Induce Nuclear Localization and Targeted Transcriptional Regulation”。本文的通讯作者是来自哈佛大学Broad Institute的Matthew Meyerson教授，其团队致力于使用基因组学的方法来探索人类疾病的产生原因。
细胞将其组成成分划分至不同的区室以调节信息传递并浓缩生物分子。真核细胞具有两个主要的区室：胞质溶胶和细胞核。蛋白质在核膜上的运输主要有两种方式，被动运输和主动运输（当蛋白质小于90 kDa时）。最近的研究进一步强调了蛋白质空间定位的重要性，相分离生物分子凝聚物的发现及其多种功能证明了这一点。蛋白质在不同区室间的易位是一些生物级联反应中的决定性事件。例如，细胞色素c从线粒体膜间隙释放到胞质溶胶以启动细胞凋亡，或者相反，将 eIF2α 隔离到无膜应激颗粒中以暂停翻译，从而促进应激条件下的细胞存活。 核运输通常是一个强有力的信号事件。许多转录因子通常存在于胞质溶胶中，但在激活后易位到细胞核。这些转录因子包括 FoxO、STAT 和核激素受体蛋白家族。 鉴于可替代蛋白质定位影响的多种生物过程，作者试图开发可以控制蛋白质定位的分子。作者假设化学诱导的邻近可用于诱导通常存在于相对区室中的蛋白质的共定位，从而将一个蛋白质从其正常位置转移到新位置。早期的研究借助FKBP/FRB系统以改变蛋白质的定位。这些研究表明，蛋白质可以被募集到细胞核或质膜中，但需要在两种蛋白质上附加可配体标签以及强定位信号，例如SV40 NLS或豆蔻酰化信号。这些研究要么使用了非常强大的天然产物，如雷帕霉素，要么使用了类药物较少的天然产物复合物，如FK506和环孢菌素A。作者旨在探索双功能化合物是否可以在不使用双标记系统的情况下，通过结合内源性蛋白质 BRD4来移动蛋白质。 作者揭示了能够诱导蛋白质从胞质溶胶易位到细胞核的双功能小分子。这些分子可能在人类健康中具有重要应用，例如癌症治疗等。 首先，作者设计并合成了双功能小分子AP1867-PEG2-JQ1(NICE-01)，并验证了化学诱导的BRD4邻近能够迅速诱导靶蛋白的核定位。 BET 溴结构域蛋白家族（BRD2、BRD3、BRD4 和 BRDT）的成员在细胞内丰度较高，具有核定位，且都是(+)-JQ1的高亲和力靶标。基于此，作者设计了一种由JQ1和AP1867组成的双功能分子，其中，AP1867是FKBPF36V的高亲和力配体。作者将该分子命名为NICE-01（Nuclear Import and Control of Expression compound 1）（图1b）。 图1. 通过 AP1867-PEG2-JQ1（NICE-01）将 GFP 快速导入细胞核
FKBPF36V-mEGFP和mCherry-BRD4共转染的细胞显示，加入NICE-01（200 nM，40 min）后，FKBPF36V-mEGFP快速易位至细胞核（图1c）。直接加入AP1867和 JQ1无法诱导这种效应。随后，作者假设内源性含BET的蛋白质可以用作核输入的“载体”。在稳定表达FKBPF36V-mEGFP的细胞中，NICE-01（250 nM，3 h）在细胞核中富集mEGFP（图1）。这种效应可以通过高浓度的JQ1或AP1867（10 μM，图1e）进行补充。
与分子胶相反，双功能化合物的一个决定性特征是观察到剂量反应在非常高的化合物浓度下降低，称为“钩效应”。在缺乏外源性 mCherry-BRD4 的细胞中，10 μM NICE-01 无法诱导FKBPF36V-mEGFP的核输入。然而，该剂量下，转染mCherry-BRD4 能够发生核输入。这些数据与理论预测一致，在给定浓度的化合物下，三元复合物形成的减少可以通过进一步添加复合物中存在的蛋白质来缓解，该蛋白质在复合物中的存在是限速的(图1f）。
最近的研究强调了参与三元复合物形成的蛋白质的化学计量对双功能分子生物活性的重要性。作者还发现，三元配合物组分的化学计量是核输入的关键。事实上，实验观察到较弱的FKBPF36V-mEGFP导入时依赖于内源性含BET的蛋白质，缺乏mEGFP胞质排斥（图1g），这可能与通过瞬时转染获得的异常高的蛋白水平有关。这一观察结果表明，核输入的细胞特异性在数量上受到核定位载体表达的影响。
mEGFP核输入可能通过两种机制发生。一种为，在存在双功能分子的情况下，目标蛋白可能与BRD4共输入，就像没有NLS的较小介质复合亚基“搭载”较大的含有NLS的亚基一样。另一种可能的机制为，目标蛋白质可能被动地扩散到核孔中，在这种情况下，双功能分子通过用BRD4隔离核部分将平衡向核输入转移，从而防止输出（“核捕获”）。
此外，作者还探究了靶蛋白的尺寸对于核易位的影响并计算了蛋白质易位时在核膜上的扩散动力学参数，构建了相关的模型（图S1）。 图 S1. 双功能分子NICE-01处理细胞后核输入的动力学参数 随后，作者探究了NICE-01的生理学应用，表明该双功能化合物可纠正癌症相关核磷蛋白的定位并改变核凝聚物。 急性髓性白血病最常见的亚型是由NPM1基因的杂合突变定义的，这种突变导致其异常的细胞质定位(NPM1c)。NPM1的突变仅发生在该蛋白的C端，并诱导移码，同时消除核定位信号并引入核输出信号(NES)。neo-NES导致输出蛋白1 (XPO1, CRM1)结合并从细胞核输出蛋白质，当NPM1c与野生型NPM1寡聚时，以显性负性方式将蛋白质定位平衡转变为主要定位在细胞质中。先前的研究表明，将细胞质突变体NPM1c重新易位到细胞核中可以减少HOX基因的表达，从而诱导白血病分化和细胞死亡。
图2. 加入双功能分子 NICE-01 后，胞质定位的 NPM1c被导入核 BRD4 凝聚物中
图3. NPM1c 将 p53 输出到细胞核外，在添加 NICE-01 后，p53无法输入核
最后，作者验证了化学诱导BRD4定位到胞质转录因子足以诱导其靶基因的表达。
图4. 细胞质定位的转录因子进入细胞核驱动转录 总的来说，本文设计了一种双功能分子NICE-01，通过研究表明，在人类细胞中，蛋白质定位可以通过结合不同细胞区室中的蛋白质的双功能分子来调节。该方法在实际应用中需要鉴定和优化蛋白质特异性结合分子，本文使用FKBPF36V和BRD4的结合证明了这一点。预计未来双功能重定位分子在科学发现和疾病治疗中将具有重要的应用。 本文作者：LD 原文引用：10.1021/jacs.3c06179 责任编辑：LD
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