给大家介绍一片来自“ACS Chemical Biology”的文章，题名为“Chemoproteomic Profiling of Protein Substrates of a Major Lysine Acetyltransferase in the Native Cellular Context”。

赖氨酸乙酰转移酶 (KAT) 家族调节真核细胞中的表观遗传学和信号通路。在这里，作者发现可点击的酰基辅酶A报告基因 3-叠氮基丙酰辅酶A(3AZ-CoA) 在细胞中呈现出显着的细胞渗透性和有效的酰化蛋白质。作者合理地设计了主要的 KAT 成员组蛋白乙酰转移酶 1 (HAT1)，以生成其突变体形式，在底物标记中对 3AZ-CoA 显示出出色的生物正交活性。作者能够应用生物正交酶-辅因子对与 SILAC 蛋白质组学相结合，在活细胞中实现 HAT1 底物靶向、富集和蛋白质组学分析。

在分析了 HAT1-Ac-CoA 复合物的晶体结构后（图 2A，），作者推测活性口袋太窄，无法容纳庞大的酰基辅酶A酰基。因此，采用凹凸法对 HAT1 的 Ac-CoA 结合位点附近的残基进行突变，以扩大乙酰基周围的空间（图1）。作者在 HAT1 的 Ac-CoA 结合袋中鉴定了七个大氨基酸残基。这些残基中的每一个都突变为空间位阻较小的氨基酸，即丙氨酸或甘氨酸（图2A）。通过使用pET28a-HAT1质粒作为模板，作者使用 QuikChange 定点诱变方案将每个选定的残基突变为丙氨酸或甘氨酸。通过在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达蛋白并随后进行Ni-NTA亲和纯化，成功获得了重组wt-HAT1和不同的eng-HAT1蛋白。wt-HAT1 和 HAT1 突变体的酰基转移活性通过使用荧光探针CPM量化副产物 CoA 来测量。分别在 392和 482 nm 的激发和发射波长下测量荧光，数据以热图格式汇总（图2B）。最终选择了 HAT1-Y282A 突变体来进一步检测 HAT1 的底物。

图1

图2

作者通过使用成像模式检查组蛋白H4上的标记效率来进一步验证 HAT1-Y282A 对叠氮化物/炔酰基辅酶A辅助因子的活性。这些凝胶内成像数据进一步支持 HAT1-Y282A 对酰基辅酶A报告基因的生物正交活性，并证明使用 HAT1-Y282A 与酰基辅酶A报告基因配对识别和成像 HAT1 细胞底物的可行性和稳健性。

图3

接下来，作者研究潜在的细胞渗透性酰基辅酶A报告基因，这些报告基因可用于分析活细胞中的 HAT1 底物。作者对一组含叠氮化物或炔烃的短链脂肪酸和酰基辅酶 A 报告基因进行了比较研究，以评估它们的细胞膜通透性和细胞蛋白标记敏感性。在所有测试的化合物中，3AZ-CoA 显示出最强烈的蛋白质标记（图4B)。结果表明 3AZ-CoA 有可能作为 KAT 底物标记的细胞渗透性生物正交报告基因。

图4

为进一步了解 3AZ-CoA 对细胞蛋白的标记，对 HEK293T 细胞进行了 3AZ-CoA 剂量依赖性处理。该结果再次支持 3AZ-CoA 作为 KAT 的生物正交报告基因具有出色的细胞渗透性。接下来，作者试图测试 3AZ-CoA 作为细胞渗透报告基因在不同类型细胞系中的普遍性。HeLa 细胞、HCT 116 细胞和 MEF 细胞用于检测细胞蛋白标记（图 4D)。总之，所有数据证明了 3AZ-CoA 作为 KAT 底物标记的细胞渗透性报告基因的能力。

作者随后研究了 HAT1-Y282A 与 3AZ-CoA 匹配是否可以在原生细胞环境下标记 HAT1 底物。首先，HEK293T 细胞用表达载体 pReceiver-M11中的全长 HAT1-Y282A 质粒进行瞬时转染。孵育 36 小时以允许细胞表达突变体 HAT1 后，用 2.5 mM 3AZ-CoA 处理细胞并再生长 12 小时。然后裂解细胞并提取细胞裂解物以通过 CuAAC 反应与炔烃-生物素缀合。接下来，生物素化蛋白通过链霉亲和素-HRP 可视化（图 5B)。结果表明HAT1 工程策略与其可渗透细胞的生物正交报告基因配对对于底物标记和从天然细胞环境中识别非常有效。

图5

为了在其天然细胞环境中发现 HAT1 底物，作者采用了定量化学蛋白质组学策略，通过使用细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记 (SILAC) 结合高分辨率质谱法。工作流程如图 6A 所示。在标记的蛋白质中鉴定出组蛋白 H4，即 HAT1 可以在赖氨酸残基 5和12乙酰化组蛋白 H4。通过 HAT1 敲除从胚胎成纤维细胞中鉴定出 65 种蛋白质，并使用基于抗体的富集来捕获依赖于 HAT1 的乙酰化蛋白质。作者发现 65 种蛋白质中有 12 种完全相同或属于同一家族，包括 H4、H2A、H2B、TPR、PPP2R2A、HSD17B、HMG、HSP、DDX、ATP6V、hnRNP 和 NCL（图 7B)。作者使用 DAVID 网络工具对 123 个 HAT1 底物进行了生物信息学分析。HAT1 底物的基因本体分析表明，HAT1 参与过多的细胞通路，包括转录、翻译、RNA 剪接、RNA 加工、蛋白质折叠、氧化还原过程、线粒体调节等（图 7C）。作者还对 HAT1 底物进行了细胞定位分析（图 7E）。发现 49 个 HAT1 底物位于细胞核中，39 个位于胞质溶胶中，27 个分布于线粒体中，其中一些重叠。因此，HAT1 的功能显然超越了细胞核处理。总的来说，这些功能注释表明 HAT1 底物广泛分布于细胞调节，这进一步证明 HAT1 不仅参与组蛋白修饰和染色质调节，还参与许多其他重要的细胞生物学功能。

图6

总之，作者已经建立了一种生物正交蛋白质组学方法，可以快速可靠地检测活细胞中单个 KAT 的蛋白质底物。生成了的HAT1 突变体（例如，HAT1-Y282A）可以容纳可点击的酰基辅酶 A 报告基因以进行底物标记。同时，作者发现 3AZ-CoA 是一种可渗透细胞的蛋白质酰化生物正交报告基因。将 KAT-酰基辅酶 A 生物正交标记对与 SILAC 蛋白质组学结合在一起，作者成功地在天然细胞环境中分析了 100 多种 HAT1 底物。HAT1 靶向众多非组蛋白细胞蛋白底物的这一发现极大地拓宽了 HAT1 调节的生物模式的范围，这远远超出了染色质领域。

本文作者：QHJ

责任编辑：FJY

原文链接：https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00935

DOI: 10.1021/acschembio.1c00935