分享的是一篇发表在JACS上的文章，标题是“Rational Screening for Cooperativity in Small-Molecule Inducers of Protein−Protein Associations”。本文的作者是来自美国马萨诸塞州剑桥市-布罗德研究所的Stuart L. Schreiber，其研究整合了化学生物学和人类生物学，以促进我们对化学和生物学的理解，以及新疗法的发现，他以使用小分子探索生物学和医学以及在化学生物学领域发展中的作用而闻名。
分子胶能够诱导协作的蛋白质-蛋白质相互作用，形成三元复合物。值得注意的是，分子胶与双功能化合物的协同作用程度不同，双功能化合物构成了蛋白质-蛋白质相互作用的第二类诱导物。然而，除了偶然发现外，对于分子胶表现出的高度协同性，目前还存在有限的合理筛选策略。作者在本文中提出了一种在存在或不存在呈递蛋白的情况下，使用“呈递比率”（三元富集与二元富集的比率）作为协同性的预测指标，对靶蛋白上的DNA条形码化合物进行基于结合的筛选。通过这种方法，作者在含有溴结构域的蛋白质（BRD）9和VHL−elongin C−eloggin B（VCB）复合物的单个DNA编码文库筛选中鉴定了一系列。这种方法可以合理地发现预选蛋白质的分子胶，从而促进向小分子疗法新范式的转变。
诱导蛋白质-蛋白质结合的小分子药物具有新的特性，具有巨大的当前医学影响和广阔的未来治疗潜力。这些“邻近化学诱导剂”（CIPs）已被证明可以稳定，降解，易位，抑制或激活蛋白质靶标，重新连接细胞回路，并将药物作用限制在共同表达其两个蛋白质伴侣的靶向组织。CIPs包括两大类：分子胶和双功能化合物（图1），分子胶表现出高协同性，尽管对蛋白质伴侣缺乏二元亲和力，但仍有利于三元复合物的形成。通常，CIPs诱导两种蛋白质的结合：一种是受调节作用的靶蛋白，另一种是对靶蛋白施加功能效应的呈递蛋白。组织特异性或细胞特异性呈递蛋白可实现分子胶的高选择性，因为仅在靶标蛋白和呈递蛋白同时存在的情况下发生生产性结合，同时，“不可成药”的蛋白质也可以被分子胶靶向。相反，尽管分子胶具有治疗优势，但分子胶的设计通常具有挑战性，并且最常被偶然发现，通过在对细胞和动物具有新功能化合物的作用机制研究中发现它们具有诱导蛋白质结合的能力。
分子胶的标志是它们在诱导蛋白质-蛋白质结合方面的高协同性。虽然已经报道了使用DNA编码文库（DEL）来鉴定能够形成三元复合物的分子的各种方法，没有人发现高度合作的化合物。作者在本文中描述了一种使用预选靶蛋白和呈递蛋白的筛选技术，以从使用DELs的拆分和组合合成策略制备的DNA条形码化合物库中鉴定双功能化合物。使用VHL-elongin C-elongin B（VCB）E3连接酶复合物作为呈递蛋白来评估细胞中诱导关联的功能结果。由此产生的非合作性PROTACs可有效诱导细胞中的三元复合物并降解其预选靶标。在这里，调整该系统以合理地从DELs中识别化合物，这些化合物协同诱导预选靶标和呈递者的蛋白质结合，所得功能化合物在体外和细胞中表现出与传统分子胶相当的协同性。
作者进行了文库设计和筛选，基于VZ185的VHL结合基序以及已报道含有溴结构域的蛋白质（BRD）9的PROTAC，设计了一种以VHL为靶向的CIP-DEL，并筛选了诱导BRD9和VHL之间关联的化合物。二元富集是通过将BTL除以BL来计算的，三元富集是通过将BTLP除以BL来计算的，通过将BTLP除以BTL来计算呈递者比率，基本上给出了三元富集与二元富集的比率（图1c）。较高的呈递者比率表明CIP-DEL化合物与BRD9的结合更依赖于VCB的存在，这意味着化合物的协同性更高。
图1 通过筛选含有和不含有VCB的BRD9，从VHL CIP-DEL中发现协作、非协作和非协作化合物。（a）分子胶和双功能化合物（红色球体）可以通过它们与两个蛋白质靶标（橙色和蓝色）诱导的三元复合物中的合作因子α定量区分。（b）CIP-DEL筛选中使用的VHL CIP-DEL库。（c）涉及靶蛋白BRD9和呈递蛋白VCB的CIP-DEL筛选流程。
BRD9/VCB的CIP-DEL筛选结果显示为三元富集度（BTLP/BL）与呈递率（BTLP/BTL）的关系图，其中每个基准点代表一个CIP-DEL库成员（图2a）。富集度和呈递者比值被报告为95%置信区间的下限。BRD9/VCB的富集化合物呈三组分布：BRD9/VCB的富集化合物分为三组：（1）高三元富集度和低呈递 率，以具有连接体9（9系列）和12（12系列）的化合物为主；（2）中等三元富集度和中等呈递者比例，以具有连接物11的化合物为主（11系列）；和（3）低的三元富集度和高的呈递体比，主要是具有连接体13的化合物（13系列）。值得注意的是，在文库中的13个连接体中，所有富集的连接体都相对较短且呈环状。根据筛选结果，选择了16个文库成员用于脱氧核糖核酸合成和生物物理和细胞验证。首先，作者使用AlphaScreen测定法用纯化的重组BRD9和VCB测试了脱DNA化合物的三元复合物形成（图2b）。诱导BRD9固定在供体珠上和VCB固定在受体珠上的三元复合物的化合物表现出发光的AlphaScreen信号。9-1是一种具有低呈递者比率（0.54）的化合物，显示出高达120 nM的AlphaScreen信号增加，但由于钩子效应，信号在较高浓度下降低（图2b）。同样，具有培养基呈递者比率（16）的化合物11-1在更宽的浓度范围内显示出AlphaScreen信号，但仍表现出高于1 μM的钩效应（图2b）。然而，13-3和13-7在13系列中都具有高呈递比率（分别为28和22）和高三元富集值，显示出增加的AlphaScreen信号，没有任何明显的钩子效应，直到最高测试浓度为10 μM（图2b）。这些结果表明，具有较高呈递者比率的化合物更具合作性。因为连接体9、11和13都是短且呈环状（图2c），因此很难仅根据其化学结构来预测被测化合物的协同性，这凸显了CIP-DEL筛选对发现协同化合物的价值。为了量化在AlphaScreen分析中观察到的脱DNA化合物的协同性，作者使用表面等离子体共振（SPR）测量了协同性因子α。BRD9化合物的α是其BRD9的二元KD与BRD9三元KD之比。BRD9的二元和三元KDs是通过将生物素化的BRD9分别用溶液中的脱氧核糖核酸化合物和溶液中的无标签VCB预孵育的脱氧核糖核苷酸化合物固定在链霉亲和素传感器芯片上来测定的。在测试的化合物中，13-7对BRD9（α>159，K表现出最高的协同性(α>159, KDbinary>20 μM, KDternary=126 nM)。VCB的α值同样是通过单独用化合物固定芯片上的生物素化VCB或用溶液中的无标签BRD9预孵育的化合物来计算的。其中9系列显示低α值，13系列显示α值，13-7高达2140(α>159,KDbinary>20 μM, KDternary=126 nM)。观察到基于筛选结果的呈递送者比率与SPR测量的协同性具有正但非线性的相关性（图2d）。基于以上筛选，作者将重点讨论13-7，它对BRD9和VCB都具有最高的协同性。为了直接测量由各种化合物诱导的二元和三元复合物的比例，我们使用非变性质谱（MS）来检测等摩尔脱氧核糖核酸化合物、BRD9和VCB的混合物中的非共价相互作用（图2e）。在MS条件下，未观察到与BRD9的二元结合。13-7观察到具有BRD9和VCB的三元复合物的大量群体（相对于未结合的BRD9），尽管其与VCB的二元结合较弱。气相非变性MS结果通过溶液相实验验证，其中将等摩尔13-7，BRD9和VCB的混合物注入尺寸排阻柱中。观察到含有BRD9和VCB的单一洗脱峰，没有明显的二元复合物或未结合的蛋白质（图2f），表明13-7诱导与BRD9和VCB协同形成三元复合物。
图2
为了评估脱DNA化合物在细胞环境中诱导三元复合物的能力，作者在HEK293T细胞中使用SmBiT-BRD9和VHLLgBiT融合蛋白进行了NanoBiT测定。在NanoBiT测定中，除VZ185外，所有化合物均未观察到钩效应。13-7在AlphaScreen测定中显示出与纯化的BRD9和VCB蛋白的协同行为（图2b），在细胞中诱导了三元复合物的剂量依赖性形成，其EC50为17 nM，在所有测试化合物中具有最高的最大效应（Emax），部分原因是在最高测试浓度为30 μM时没有任何钩效应。由于作者在CIP-DEL筛选中的呈递蛋白是VCB，因此使用HiBiT测定评估BRD9降解作为BRD9/VCB化合物诱导的三元复合物形成的功能结果。虽然效力低于VZ185，但13-7在HEK293T细胞中降解了BRD9-HiBiT融合蛋白（半最大降解浓度（DC50）108 nM）且没有钩子效应（图3c）。13-7诱导的BRD9降解至少部分依赖于VHL，HiBiT测定信号的减少归因于BRD9降解而不是细胞毒性（图3c）。使用HiBiT测定法测得的最大降解（Dmax）计算脱氧核糖核酸外化合物的降解选择性需要谨慎，因为大多数测试化合物都表现出非VHL介导的降解。13-7、13-3和13-2等具有高协同性的化合物，在BRD9降解中表现出更大的VHL依赖性和更低的脱离机制效应。为了验证HiBiT结果，作者使用荧光激活细胞分选（FACS）来测量BRD9-GFP融合蛋白对HEK293T细胞中选定化合物的降解（图3d）。向过表达BRD9-GFP的细胞中添加13-7（10 μM）导致GFP信号强度降低，而不影响mCherry信号，与BRD9-GFP蛋白的丢失一致（图3d）。与蛋白酶体抑制剂MG132的共同处理避免了这种效应，证明13-7诱导BRD9-GFP的蛋白酶体降解。蛋白质印迹分析证实，在13-7诱导的BRD9-GFP降解中没有钩效应，最高测试浓度为30 μM（图3e）。
图3
综上所述，在这项研究中，作者证明了使用基于结合的CIP-DEL方法来鉴定诱导三元复合物形成和靶点降解的化合物的可行性。通过筛选大约一百万个DNA条形码化合物的文库，对照有和没有VCB的BRD9，确定了属于相反极端的化合物：具有高三元富集但低呈递者比率的9系列和具有低三元富集但高呈递者比率的13系列。但值得注意的是，多样化的三嗪文库不仅具有与BRD9结合的潜力，还具有与其他靶蛋白结合的潜力，以追求分子胶发现。随着我们努力扩大研究结果的范围，以验证以这种方式分析BRD9/VCB以外的系统的数据的通用性，并探索在CIP-DEL中使用单价分子的潜在益处，包括改善药物特性。这些工作与分子胶作为降解剂和三元复合物抑制剂的临床验证日益增加相一致，旨在促进分子胶在下一代疗法中的理性发现与设计。
本文作者：SY
原文引用：https://doi.org/10.1021/jacs.3c08307
责任编辑：LD
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