分享的是一篇今年3月份发表在JACS上的文章，本文的通讯作者Joseph M. Fox是来自特拉华大学化学和生物化学系教授，研究集中在开发新型化学反应，将这些新反应应用于具有生物功能的自然产生和设计的分子的合成，以及将设计概念应用于生物学和材料科学的有机合成。

在实现生物系统控制所需的时空控制方面，光发挥了关键作用。传统上，这些过程是通过紫外线或短波长光的激发来激活的。光笼和光亲和标记已经成为调节和探测小分子活性的主要手段，而光活化生物正交化学（光点击化学）已成为标记生物分子的工具。突出的例子光催化和长波长的光被用来启动二氢四嗪（DHTz）的氧化，从而激活与荧光标记的反环辛烯的快速双分子化学反应。

Fig1.远红光对亚细胞定位的光催化脱笼

首先，作者设计了一种基于二氢四嗪-四嗪氧化还原化学的光催化诱导型光笼，设计了结构A的DHTz-乙烯基醚，氧化后生成四嗪B，该四嗪B位于分子内4+2环加成反应中生成加合物C，DFT计算用来预测分子内环加成的可行性（图2）。

Fig2.新型光脱笼分子设计

之后，作者合成了合成了基于DHTz的光氧化笼，化合物1被设计用来释放哒嗪2和n-CA4，这是一种强效的微管蛋白抑制剂。还制备了对照化合物4，它是1的二氢类似物，缺乏烯烃基，因此不能释放n-CA4。SiR-Hoechst共轭物SiR-H衍生物将荧光基团锁定在细胞核中的DNA上，而SiR-docetaxel共轭物SiR-T将荧光基团锁定在管蛋白上（图3）。

Fig3. 光笼化合物的合成

作者使用紫外可见分光和HPLC分析监测使用模型化合物3的光催化氧化和脱笼研究（Fig4）。在SiR（2 μM，5 mol %）的存在下，用660 nm的光照射3（40 μM）20分钟，导致2和苯酚的释放。通过HPLC，产品的产率分别为86%和84%（图4A）。每隔20秒用紫外-可见光谱仪监测脱笼，以跟踪起始材料、中间产物和产物的存在（图4C）。

化合物3在227 nm处有紫外可见的最大吸收，而产物化合物2在275 nm处有紫外最大吸收。在光化学反应过程中进行了紫外可见光谱监测，显示由于3的转化，227 nm处的吸光度下降，同时275 nm处的吸收增加（图4B，C）。在实验过程中，310 nm处的吸收暂时增加，然后减少，这与一个中间物的形成相一致。这个中间物引起的吸收在80 s后达到最大值（图4C,D中的蓝线），并以半衰期∼100 s衰减。

Fig4. 光催化释放研究

接下来，作者使用化合物1和核定位的SiR-H光催化剂处理NIH3T3小鼠成纤维细胞来研究细胞内n-CA4的光脱笼。对于载体对照（DPBS中的0.1% DMSO），细胞表现出拉长、聚合和有组织的微管结构（图5B，左）。用n-CA4（10 nM）处理后，细胞显示出微管细胞骨架的崩溃和细胞面积的减少（图5B，中）。同样，用光催化脱笼处理的细胞表现出解聚的微管（图5B，右）。

然后将每个样品的平均面积进行归一化，并绘制出样品与vehicle对照之间的百分比差异（图5C）。负值的数据表示细胞面积相对于对照的减少，意味着微管解聚，而数据在零或零左右表示细胞面积变化不大。与对照相比，用n-CA4处理的细胞在光照下显示出20%（+/-4.2%）的细胞面积减少。同样，在脱笼条件下（化合物1+SiR-H+光）处理的细胞，面积减少21%（+/-3.0%）。在没有光或光催化剂的情况下，1对细胞面积没有明显影响。用4处理的细胞，缺乏释放所必需的烯烃，无论是否有光催化剂和/或光，都没有显示细胞面积的变化（图5C）。此外，使用缺少诱导脱笼的条件（缺乏光、SiR-H或烯）处理细胞显示拉长和有组织的微管（图5D）。

Fig5. 定位于亚细胞内光脱笼

为了进一步证明光脱笼是由于SiR-H的亚细胞定位而发生的，抗坏血酸被用来作为光催化的细胞外淬灭剂。由于抗坏血酸（Ascorbate）的细胞渗透性很差细胞内定位的SiR-H不会受到抗坏血酸的影响，所以仍然可以观察到成功的脱笼（图6A）。然而，细胞不可渗透的SiR衍生物（SiR-X）（图6D）将被抗坏血酸淬灭，预计不会发生光脱笼（图6B）。如预期，单独用抗坏血酸处理的细胞显示出拉长的微管结构，而用n-CA4和抗坏血酸处理则导致微管解聚。在抗坏血酸存在的情况下，1+SiR-H（定位到细胞核），显示出解聚的微管，与成功光脱笼一致（图6E）。然而，在相同的条件下，用1+SiR-X，即细胞不可渗透的光催化剂处理，并没有导致微管的解聚。这些结论得到了细胞面积定量数据的进一步支持（图6F）。

Fig6. 光脱笼发生在细胞内环境

最后，作者通过共聚焦显微镜来观察细胞中光催化脱笼的实时结果。通过将SiR定位到微管蛋白（SiR-T）上，对微管进行成像，每5分钟一次，持续45分钟。在这段时间内，可以观察到稳定的微管解聚，45分钟后，微管结构的大小和亮度减弱，正常的微管中看到的细长结构消失（图7A）。在缺少烯烃对照实验中，没有看到微管结构的变化，这表明光照射对脱笼是必要的（图7B）。

Fig7. 定位于微管蛋白(SiR-T)的光脱笼实时成像

总之，作者描述了一种基于分子内四嗪连接的新型光笼，并在活细胞的细胞器水平上激活。使用市售的Sia-Hoechst(SiR-H)和SiR-docetaxel(SiR-T)分别定位于细胞核和微管，并使用一类新的氧化还原激活的光脱笼释放微管去稳定剂n-CA4。实验表明，n-CA4在细胞内而不是在细胞外环境实验光脱笼。使用SiR-T，可作为光催化剂和微管解聚的荧光报告基因，可以实时显示活细胞中光催化脱笼的结果。

文章作者：WCJ

原文引用：10.1021/jacs.2c10655

责任编辑：LD