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天然产物是自然界长期进化的产物，是生物活性物质和药物研发的源泉。通过基因工程技术，将天然产物生物合成基因和基因簇在微生物中异源表达，在节约成本，保护生态等方面有重大的意义。 多酶复合物的形成使酶活性位点接近，以促进中间代谢物的转移，隔离中间渗漏并简化代谢流向所需产物。这里香港中文大学夏江课题组总结了几种在微生物细胞内的多酶复合物的结合方式，从静态的纳米酶结构（有支架或无支架）到基于液液相分离的动态酶凝聚层。
图1. 构建合成多酶复合物的三种策略：无支架、支架支持和相分离。 大多数天然多酶复合物并不需要支架，而是以domain-domain相互作用来组装成不同的催化单元，例如脂肪酸合酶和聚酮合酶 [1-5]。这些能够以共价或非共价形式结合的结构域是天然的酶组装工具箱。如果将这些结构域融合到不影响催化酶活性的位点（通常为末端），催化酶会自发组装，形成无支架复合物。受到天然多酶复合物的启发，香港中文大学夏江课题组利用RIAD和RIDD这对短肽，将萜类化合物虾青素和番茄红素合成途径中的限速步骤催化酶组装在一起，形成新的催化节点，将MVA途径和萜类生物合成途径流线化，在大肠杆菌和酿酒酵母中都实现了代谢通量的优化[6]。 利用蛋白质、核酸等生物大分子作为支架构建多酶复合物是最常见的多酶组装方式。利用Dueber 等人设计的合成蛋白质支架，基于蛋白质-肽相互作用（基于 SH3、SH2 和 PDZ 结构域）在甲羟戊酸生物合成途径中组装了三种顺序酶。他们实现了对代谢通量的有效控制，使产物效价提高了77倍[7]。除了线性蛋白质支架外，蛋白质笼也可用作酶组装的支架，并且最近在疫苗开发中受到了极大的关注[8-10]。工程师将酶封装在笼子内，使其与细胞质中其他的代谢途径隔离开来。巧妙的是，通过对笼子的孔径进行微调，可以控制笼子的稳定性和进出笼子的分子流量[11-14]。通过核酸大分子构建起来的有序纳米结构支架通常被称为“DNA折纸”[15-16]。Conrado等人使用质粒 DNA 作为支架，在大肠杆菌的细胞质中排列生物合成酶。质粒DNA中独特的锌指结构通过特异性结合引导酶至DNA模板上，经验证，包括白藜芦醇、1,2-丙二醇和甲羟戊酸在内的多种代谢产物的滴度随着支架结构的增加而增加[17]。 由于天然细胞器自身的结构和功能具有完整性和独立性，利用天然细胞器封装多个酶进行组装引起了科学家们的广泛兴趣[18-20]。尼尔森等人[18]基于过氧化物酶体是脂肪酸降解的细胞器这一认识，将过氧化物酶体变成了脂肪酸衍生物生产的工厂，使脂肪酸衍生品如脂肪醇、烷烃和烯烃的产量提高到 700%。更值得一提的是，作者增加了过氧化物酶体数量，让产量又进一步提高3倍。 基于液液相分离形成的细胞内凝聚体是一种蛋白质组装的新型无膜细胞器。在相分离过程中形成的液滴可以在有限的体积内浓缩高达上百倍浓度的蛋白质并同时保持液体的流动性。这一特性赋予了酶催化过程中的底物，中间产物和辅因子交换迅速的特性，这使得相分离可以在天然产物的生物合成中作为一个有效的多酶组装体。例如作者课题组在体外通过多肽-多肽相互作用将酶引入三蛋白组分（Shank，Homer和GKAP）形成的相分离，成功提升了催化效率[21]。基于此，作者课题组还进一步实现了在大肠杆菌体内单一蛋白（RGGRGG）凝聚体的构建，并将萜类化合物的生物合成酶组装到凝聚体内进而实现了法呢烯的产量提升[22]。 图2. 通过蛋白质相分离进行多酶组装 多酶复合物优化了微生物内部的代谢通量，提高了产物效价。尽管如此，用于大规模生产有价值化学品的合成多酶复合物的工业应用尚未实现。该领域仍在寻求新的策略来更好地平衡动态性和限制性，并像天然多酶复合物一样更好地控制细胞中的局部区室化。 WILEY 参考文献： [1] K. Singh, B. Graf, A Linden, V. Sautner, H. Urlaub, K. Tittmann, H. Stark, A. Chari, Cell 2020 180 1130-1143. e20. [2] P. Johansson, B. Wiltschi, P. Kumari, B. Kessler, C. Vonrhein, J. Vonck, D. Oesterhelt, M. Grininger, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008 105 12803-12808. [3] S. R. Bagde, I. I. Mathews, J. C. Fromme, C.-Y. Kim, Science 2021, 374, 723-729. [4] M. Leibundgut, S. Jenni, C. Frick, N. Ban, Science 2007, 316, 288-290. [5] T. Robbins, Y.-C. Liu, D. E. Cane, C. Khosla Curr. Opin. Struct. Biol. 2016, 41, 10-18. [6] W. Kang, T. Ma, M. Liu, J. Qu, Z. Liu, H. Zhang, B. Shi, S. Fu, J. Ma, L. T. F. Lai, Nat Commun. 2019, 10, 1-11. [7] J. E. Dueber, G. C. Wu, G. R. Malmirchegini, T. S. Moon, C. J. Petzold, A. V. Ullal, K. L. Prather, J. D. Keasling, Nat. Biotechnol. 2009, 27, 753-759. [8] S. Chakraborti, T.-Y. Lin, S. Glatt, J. G. Heddle, RSC Adv. 2020, 10 13293-13301. [9] J.-S. Ra, H.-H. Shin, S. Kang, Y. Do, Clin. Exp. Vaccine Res. 2014, 3 227-234. [10] T. N. Szyszka, E. N. Jenner, N. Tasneem, Y. H. Lau, ChemSystemsChem 2022, 4, e202100025. [11] I. Stupka, Y. Azuma, A. P. Biela, M. Imamura, S. Scheuring, E. Pyza, O. Woźnicka, D. P. Maskell, J. G. Heddle, Sci. Adv. 2022, 8, eabj9424. [12] N. Tasneem, T. N. Szyszka, E. N. Jenner, Y. H. Lau, ACS Nano 2022. [13] L. S. Adamson, N. Tasneem, M. P. Andreas, W. Close, E. N. Jenner, T. N. Szyszka, R. Young, L. C. Cheah, A. Norman, H. I. MacDermott-Opeskin, Sci. Adv. 2022, 8, eabl7346. [14] W. M. Aumiller, M. Uchida, T. Douglas, Chem. Soc. Rev. 2018, 47, 3433-3469. [15] T. Tørring, N. V. Voigt, J. Nangreave, H. Yan, K. V. Gothelf, Chem. Soc. Rev. 2011, 40, 5636-5646. [16] P. Wang, T. A. Meyer, V. Pan, P. K. Dutta, Y. Ke, Chem 2017, 2, 359-382. [17] R. J Conrado, G. C. Wu, J. T. Boock, H. Xu, S. Y. Chen, T. Lebar, J. Turnšek, N. Tomšič, M. Avbelj, R. Gaber, T. Koprivnjak, J. Mori, V. Glavnik, I. Vovk, M. Benčina, V. Hodnik, G. Anderluh, J. E. Dueber, R. Jerala, M. P DeLisa, Nucleic Acids Res. 2011, 40, 1879-1889. [18] Y. J. Zhou, N. A. Buijs, Z. Zhu, D. O. Gomez, A. Boonsombuti, V. Siewers, J Nielsen, J Am Chem Soc 2016, 138, 15368-15377. [19] J. E. Kim, I. S. Jang, S. H. Son, Y. J. Ko, B. K. Cho, S. C. Kim, J. Y. Lee, Metab Eng 2019, 56, 50-59. [20] K. Thodey, S. Galanie, C. D. Smolke, Nat Chem Biol 2014, 10, 837-44. [21] M. Liu, S. He, L. Cheng, J. Qu, J. Xia, Biomacromolecules 2020, 21, 2391-2399. [22] Y. Wang, M. Liu, Q. Wei, W. Wu, Y. He, J. Gao, R. Zhou, L. Jiang, J. Qu, J. Xia, Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202203909. 论文信息 Synthetic Multienzyme Assemblies for Natural Product Biosynthesis Min Liu, Yue Wang, Hao Jiang, Yongxu Han, Prof. Dr. Jiang Xia ChemBioChem DOI: 10.1002/cbic.202200518
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