抗体偶联药物（Antibody drug conjugate，ADC）由单克隆抗体、连接子及小分子细胞毒药物组成。在具有单克隆抗体特异性的同时，兼顾小分子细胞毒药物的高毒性，是目前抗体药物的主要发展方向之一。传统ADC偶联方法利用抗体的氨基酸残基偶联小分子药物，导致生成含有多种药物抗体比（Drug-antibody ratio，DAR）的异质性ADC药物，影响安全性和有效性。因此，ADC药物的DAR分析是成药性研究阶段的重要内容，常采用色谱法进行测定。其中，疏水作用色谱法（Hydrophobic interaction chromatography，HIC）能够在非变性条件下分析完整ADC，但需要高浓度、难挥发盐溶液作为流动相支持，与质谱（mass spectrometry, MS）相容性较差。反相色谱（Reversed-phase liquid chromatography，RPLC）通常联合QTOF-MS使用，可直接通过解卷积得到不同DAR的ADC谱图，但该方法需采用高柱温和高比例有机相，具有潜在的蛋白变性可能条件。尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）能够在中性pH和室温条件下进行DAR分析，采用高挥发性缓冲盐作为流动相，与MS相容性较好。目前，ADC药物的异质性仍是分析方法开发的瓶颈，为解决传统ADC的异质性问题，作者开发了位点特异性的抗体偶联方法（Affinity Peptide Mediated Regiodivergent Functionalization of Native Antibodies，AJICAP^TM），并比较了6种不同DAR分析方法对AJICAP ADC的分析性能及优缺点。

    AJICAP位点特异性ADC偶联方法的工作流程如图1所示，与传统ADC偶联方法的主要区别在于其合成抗体Fc段亲和性多肽，与抗体反应后生成具有Fc段选择性的中间体，提供2个重链（Heavy chain, HC）上的偶联位点，随后通过化学反应将偶联成功的多肽置换为巯基，并进一步置换为小分子细胞毒性药物一甲基澳瑞他汀E（Monomethyl auristatin E， MMAE），完成AJICAP ADC的化学合成。

图1 AJICAP位点特异性ADC偶联方法的工作流程

    该文中，作者比较了6种DAR分析方法：RPLC法，采用0.1%三氟乙酸水溶液/乙腈体系，柱温80℃；两种HIC-HPLC法，采用硫酸铵/磷酸二氢钠缓冲盐体系，区别为体系A中流动相加入25%异丙醇，而体系B不含异丙醇，柱温均为25℃，检测波长280nm；RPLC-QTOF-MS法，采用0.1%甲酸水/乙腈体系；SEC-Q-TOF-MS法分为变性和非变性两种条件，变性条件流动相体系为含1%甲酸和0.01%三氟乙酸的50%乙腈水溶液，非变性条件流动相采用150mM醋酸铵水溶液。

    首先，作者比较了6种方法对于未纯化AJICAP ADC样品的DAR分析结果。如表1所示，6种分析方法对未纯化ADC DAR测定结果有所差异，主要体现在HIC-HPLC法分析中出现了DAR=3的色谱峰，作者认为这是偶联反应中抗体Fc段单侧偶联2个MMAE导致的副反应产物，同时提示RPLC-Q-TOF-MS和变性条件下的SEC-Q-TOF-MS在偶联反应条件筛选研究中可能不具备发现副产物的能力。

表1 6种分析方法对未纯化AJICAP ADC样品的DAR分析结果

    其次，作者比较了6种方法对于纯化后AJICAP ADC样品的DAR分析结果，如表2所示，6种分析方法对纯化后的ADC DAR测定结果均达到预期。通过RP-HPLC结果可知，该ADC偶联方法特性良好，轻链（Light chain, LC）无副产物，HC特异性达到91.3%。

表2 6种分析方法对纯化后AJICAP ADC样品的DAR分析结果

    接下来，作者对各DAR分析方法进行了深入分析。如图2所示，RP-HPLC结果显示，色谱图中最强峰和次强峰分别为HC+MMAE和LC，符合预期结果。对未偶联HC洗脱部分做深入研究，发现样品中仍含有未反应的中间体3，RP-HPLC方法能够快速，准确的评估偶联反应特异性及副反应情况。如图3所示，HIC-HPLC结果显示，含有25%的体系A能够增加不同DAR ADC样品的分离度，但高比例的有机溶剂存在使ADC样品变性，导致保留时间和响应发生变化的风险，不含异丙醇的体系B同样可以得到较好的分离度和色谱峰型，且方法稳定性更好，作者认为，不添加有机溶剂的HIC-HPLC流动相体系应更适宜于ADC样品的分析。

图2 RP-HPLC方法分析ADC DAR的色谱图

图3 HIC-HPLC方法分析ADC DAR的色谱图

（A：体系A；B：体系B）

    如图4所示，RPLC-Q-TOF-MS和HIC-Q-TOF-MS方法均能适用于AJICAP ADC样品的DAR分析，且未纯化和纯化样品的DAR分布均符合预期。RPLC-Q-TOF-MS法需要对样品做脱盐处理，存在使ADC载药小分子游离的风险，但该方法起始ADC用量少，方法开发速度快，适用于ADC偶联反应的前期筛选和优化。而SEC-Q-TOF-MS方法则无需对ADC样品进行脱盐处理，且根据实验需求，可选择变性或非变性条件。其中，变性条件无需复杂的样品前处理，适用于偶联反应的实时监测，非变形条件直接分析完整蛋白，可以进行准确定量，是准确、快速分析AJICAP ADC 的DAR值的最佳方法。

图4 RPLC-Q-TOF-MS和SEC-Q-TOF-MS的解卷积质谱图

（A：RPLC-Q-TOF-MS法分析未纯化ADC，B：变性SEC-Q-TOF-MS法分析未纯化ADC，C：非变性SEC-Q-TOF-MS法分析未纯化ADC，D：RPLC-Q-TOF-MS法分析纯化ADC，E：变性SEC-Q-TOF-MS法分析纯化ADC，F：非变性SEC-Q-TOF-MS法分析纯化ADC）

    最后，根据比较6种分析方法的结果，作者建立了一种最适宜AJICAP ADC DAR分析的SEC-Q-TOF-MS方法，如图5所示，该方法能够在10min内完成DAR测定，并同时完成ADC偶联反应副产物监测。

图5 SEC-Q-TOF-MS方法分析AJICAP ADC DAR解卷积谱图

    总结该文，作者在之前建立的AJICAP ADC偶联技术基础上，研究了不同分析方法对于AJICAP ADC的DAR分析的适用性和优缺点，根据每个DAR分析方法的结果和特点，提出了不同方法对于ADC DAR研究的适宜范围，并最终建立了一种快速的SEC-Q-TOF-MS方法进行ADC DAR分析。该文是对AJICAP ADC药物的DAR分析方法较为完整的研究，其研究思路和实验设计也值得其他抗体、多肽药物的研究工作者们参考和借鉴。

参考文献

Matsuda Y, Robles V, Malinao M C, et al. Comparison of Analytical Methods for Antibody–Drug Conjugates Produced by Chemical Site-Specific Conjugation: First-Generation AJICAP[J]. Analytical chemistry, 2019, 91(20): 12724-12732.

文献整理：唐煜；编辑：生宁、张金兰；第159期