该酶通过双核铁活性中心活化氧气，其中的还原性二铁位点可与氧气反应产生各种过氧中间体，包括过氧中间体P或P’，超氧中间体物种S，Q中间体或者X中间体等。在不同的亚类酶中，用于催化反应的活性过氧中间体是不同的（图2）。

甲苯/邻二甲苯单加氧羟化酶单链包括αβγ三个结构域（图三），处于α结构域的双核铁活性中心包括两个组氨酸和四个谷氨酸，两个铁离子都是六配位结构，Lippard课题组通过{attr}3227{/attr}实验提出了反应活性过氧中间体为μ-η²:η²构型，但并没有直接的结构证明该酶中的活性中间体是哪种构型。

近日，华中科技大学廖荣臻课题组采用QM/MM方法对甲苯/邻二甲苯单加氧羟化酶进行理论计算模拟，揭示了可能的反应活性过氧中间体结构，探究了氧氧键断裂和底物氧化是分步还是协同进行的问题，还阐释了为何该酶可将甲苯氧化为苯酚产物而不是酮或者环氧化物产物。

通过计算发现μ-η²:η²的过氧中间体是最稳定的，通过主轨道相互作用分析发现是两个铁离子的3d轨道与过氧基团的π*轨道形成的反馈键是主要成键成分。接下来对氧氧键断裂和碳氧键形成的分步机理进行研究。计算表明形成四价铁物种Q的能垒是19.8 kcal/mol，对形成Q中间体的扫描势能面进行分析，发现从过氧中间体到Q中间体的过程中，会发生Fe1上的β电子转移到氧氧键的σ*轨道上。在协同反应机理中，发生氧氧键的断裂和碳氧键形成的过渡态能垒为16.8 kcal/mol，形成碳氧键后的甲苯底物具有阳离子性质，第一步反应为速率决定步骤。形成碳氧键中间体结构后会发生不同形式的变化，其中发生质子穿梭形成苯酚产物能垒很低且是放热过程，而形成环氧化物或酮产物的能垒较高。