GlmD{attr}3189{/attr}RPS模块3中的CA₃T₃E蛋白结合的最佳底物L-Asp发生反应，产生β-OH-L-Asp，与终产物1中β-OH-D-Asp相比构型发生了异构。异构化结构域（E domain）处于该基因簇的中部，因此推测E结构域的真正催化底物是硫醇化结构域（T domain）绑定的肽酰，而不是T绑定的氨酰。T绑定的肽酰在体内发生异构化后，经多步模块反应形成终产物1。因此证明了GlmD催化Asp羟基化，且优先于异构化。GlmF催化NRPS模块1中IA₁T₁蛋白结合的底物L-His发生反应，产生羟基化组氨酸（threo-β-OH-L-His），而A₁T₁蛋白则不产。为进一步验证该结果，负责脂肪酸链加载的GlmE蛋白分别与其进行反应，结果显示实验组均可以产生目标产物8和9，但A₁T₁蛋白组中的产量较IA₁T₁蛋白组的产量降低了90%。这一结果表明，I结构域在GlmF催化组氨酸羟基化的形成过程中起着重要作用。

I结构域是缩合结构域（C domain）的一个新分支，仅包含保守位点Asp，而缺少了保守的催化位点His。I结构域呈V字型，由N端亚结构域和C端亚结构域构成。作者发现R18，R19和R310三个位点阻断了底物结合口袋，保守位点R344的缺失使得T结构域无传递底物的结合位点。因此I结构域不能结合底物且不具有催化活性。突变结果显示，I结构域的突变体E54和D166与GlmF的互作条带消失，且E54和D166影响终产物1和2及体外目标产物8的产量。E54和D166在空间位置很近且氨基酸侧链均朝外，因此I结构域是通过保守位点E54和D166介导与GlmF的相互作用。与催化游离氨基酸底物的羟化酶相比，GlmF在结构上呈现一个特殊的entrance helix，推测其在羟基化氨基酸形成过程中与T结构域负责的底物呈递存在相关性。基于以上结果，首次提出组氨酸羟基化产生机制：A₁结构域识别L-His，递送形成T₁-L-His；I结构域通过E54和D166招募羟化酶GlmF；T₁结构域将底物递送至GlmF的底物结合口袋，发生羟基化后，T₁结构域进一步将羟基化底物递送至GlmE的C结构域催化口袋，与脂肪酸链发生缩合。

硫酯酶结构域（TE domain）通过水解或环化方式从装配线上释放天然产物。体内和体外结果表明，S-Apo可由T结构域绑定的氨基酸底物Dab自发的亲核攻击而形成，无需酶催化。但与此同时，根据体内外相应产物产量的比较，作者推测在Glidomide合成装配过程中TE可能保护或维持T结构域绑定的氨基酸底物Dab不发生环化，待T绑定正确的肽酰产物时，TE可能促进Dab的自由氨基攻击羰基而形成Apo，并释放终产物。

本研究不仅为β-羟基化非天然氨基酸的生物合成提供了研究思路，而且在重新设计并改造NRPS获得更多新型天然产物方面具有指导意义。