在之前的研究中，作者证明了DZA片段携带的遗传信息可在原核细胞（大肠杆菌）中精确传递。相比于传统的基因克隆方法，酵母体内组装技术具有无酶消化、无体外连接、无多步纯化等优势，因此作者选择其作为真核细胞模型。

作者先模拟设计了三种不同的质粒组装。将红色荧光蛋白基因（RFP）DNA片段与载体组装，构建空白对照质粒（blank-DNA-RFP）。再将DZA RFP基因和DNA RFP基因与携带有GFP的载体组装，构建DZA-RFP-GFP和DNA-RFP-GFP。如果酵母细胞能成功识别插入的DZA或DNA片段，则选择琼脂平板上可检测到绿色和红色荧光克隆（图2）。

作者接下来以blank-DNA-RFP为模板，通过PCR扩增获得DZA-RFP和DNA-RFP片段。作者发现嘧啶修饰核苷酸的扩增效率显著高于嘌呤修饰核苷酸（图3a）。作者推测7-deazaG修饰低效率的实际原因是含7-deazaG的PCR产物不易被DNA染料染色，而并非PCR产物的量少。而7-deazaA修饰低效率的原因是RFP基因中AT含量过高，多个连续修饰A的插入不利于DZA片段的合成。作者还用LC/MS-MS进一步验证了DZA-RFP-GFP片段中碱基的修饰（图3b）。

随后，作者将blank-DNA-RFP、DNA-和DZA-RFP-GFP与线性化载体共转染进酵母细胞中。为了排除污染，作者还设置了多个质控步骤以确保表达蛋白的来源为合成的DNA和DZA。实验结果发现DZA-RFP-GFP组产生了黄色克隆，这表明酵母可正确的识别DZA片段并将其翻译成功能性的荧光蛋白（图4）。

最后，作者发现目的基因的表达不会影响细胞的生长（表1）。然而，当RFP基因被A*修饰后，红色荧光蛋白克隆比例显著降低。作者推测既可能是因为RFP基因中的poly-A结构，也可能是因为7-deazaA的高突变累积导致了酵母死亡。作者对酵母的RFP片段进行了测序验证了猜想。

综上所述，作者在这篇文章中报道了一种在真核细胞中引入非天然核酸的方法。由7-deazaA, 5-CIU, 7-deazaG和5-FC组成的复杂长片段DZA基因可用于编码荧光蛋白。酵母细胞以同源重组的形式识别和利用这些合成DZA片段。该酵母体内组装方法无需额外酶参与，避免了可能的损失和污染。通过对该方法进行进一步优化，未来可用于糖环或骨架修饰的其他非天然核酸的组装。