第一作者：Shizheng Wang

通讯作者：高学云，任晓君

通讯单位：北京工业大学

研究内容：

个体细胞间RNA剪接变异的差异表达解释了细胞基因表达的异质性，在免疫系统调控中起着关键作用。然而，目前的技术在实现RNA剪接变体的高碱基分辨率、高空间分辨率和精确定量的单细胞分析方面存在困难。该研究构建了DNA模板双功能纳米团簇探针，以实现在单细胞水平上的RNA剪接变异的原位成像和精确定量。通过设计超小纳米团簇标记探针直接靶向RNA剪接变体的剪接点序列，显着提高了碱基识别分辨率。受益于纳米团簇的可控荧光，实现了 RNA 剪接变体的原位成像和基因分型。由于原子精确的纳米簇，RNA 剪接变体可以通过激光烧蚀电感耦合等离子体质谱法在单细胞水平上准确量化。研究者进一步应用探针探索免疫激活下单核巨噬细胞中 MyD88 剪接变体的功能。该策略为研究免疫系统功能多样性和剪接相关免疫疾病提供了一种新的单细胞分析工具。

on style="text-align: center; text-indent: 0em;"> 示意图1: 用于剪接变异分析的EJNC探针概述

该研究开发了双功能 DNA 模板化纳米团簇探针，可用于在单细胞水平上轻松分析 RNA 剪接变体。改探针有以下特点：

(1) 利用纳米团簇探针空间位阻小、直接靶向RNA剪接位点的特点，实现了RNA剪接变异体的高碱基识别分辨率。

(2) 基于纳米团簇探针的可控荧光和不同金属元素，实现了RNA剪接变异体的原位成像和基因分型。

     (3) 由于原子精确的纳米团簇，通过 LA-ICP-MS 对 Au 或 Ag 进行计数，可以在单细胞水平上准确定量 RNA 剪接变体。

此外，这些探针还用于分析免疫激活下单核巨噬细胞的 RNA 剪接变体。研究发现MyD88_S和MyD88_L都增加了。此外，还发现MyD88_S和MyD88_L的单细胞相关系数在LPS刺激下增加，这是以前基于细胞群体的技术没有观察到的。实际上，该方法也有局限性，检测吞吐量受金属元素类型的限制，忽略了亚细胞信息。未来，可以通过标记镧系金属元素来提高该策略的多路复用能力。此外，不同的金属标记探针可以与原位RCA和DNA编码相结合，实现了RNA剪接变体在单分子水平上的高通量成像，从而在提高产量的同时获得亚细胞空间信息。然而，改方法可以用于研究细胞间的变异，并有望解释免疫功能的多样性和确定疾病背后的因果机制。

图1：EJNC探头的设计。(A) Au-EJNC和Ag-EJNC探针设计合成示意图。(B)不同DNA序列合成Ag-EJNC的荧光光谱。(C)不同DNA序列合成的Au-EJNC探针的荧光光谱。

图2：EJNC 探针的表征。(A) Au-EJNC (红线) 和 Ag-EJNC (绿线) 探针的荧光和紫外可见吸收光谱。Au-EJNC 和 Ag-EJNC 探针在可见光（左）和 365 nm 便携式紫外灯（右）下的数字照片。HP-MyD88_L和 MyD88_S的 DNA 序列用作对照（黑线）。(B) 游离 DNA 序列 HP-MyD88_L（左）和 Au-EJNC 探针（右）的 MALDI-TOF-MS 光谱。(C) 游离 DNA 序列 MyD88_S（左）和 Ag-EJNC 探针（右）的 MALDI-TOF-MS 光谱。

图3:  利用EJNC探针对MyD88剪接变体进行原位成像。(A和C) 通过Au-EJNC(红色)和Ag-EJNC(绿色)探针在未处理和LPS处理的RAW264.7细胞中观察MyD88_L和MyD88_S的荧光图像。(B和D) FISH探针检测MyD88_L和MyD88_S在未处理和LPS处理RAW264.7细胞中的荧光图像。MyD88_L的 FISH 探针用 Cy5 标记，MyD88_S的 FISH 探针用 Alexa488 标记。(E) EJNC 探针在阻断目标位点后对 MyD88_L和 MyD88_S 的荧光图像。(F) 对照组（没有 EJNC 探针）。

图4：通过 EJNC 探针对 MyD88 剪接变体进行单细胞定量。(A) 由 LA-ICP-MS 测定的不同浓度 (1-25 μM) Au-EJNC 和 Ag-EJNC 探针的单个 RAW264.7 细胞的瞬态 Au 和 Ag 信号。(B) LA-ICP-MS 对 Au 和 Ag 标准品的校准曲线。插图：通过喷墨打印获得的标准。(C) 单个细胞中Au和Ag质量的浓度优化曲线来自图A中Au和 Ag 信号的统计分布。(D)同时标记与单独标记结果的比较得出 R2 = 0.99，斜率为 0.989。

图5：分析LPS刺激后不同变体之间的表达协变。(A)未经处理（左）和LPS处理的 RAW264.7 细胞（右）的瞬态 Au 和 Ag 信号。(B) LPS刺激下细胞内TLR信号的可变剪接和调节示意图。(C)未经处理和经LPS处理的RAW264.7细胞上Au和Ag质量的箱线图。Au质量代表MyD88_L的表达，Ag质量代表MyD88_S的表达。***表示两组间有统计学意义的差异，***p < 0.001。(D) RT-qPCR 刺激前后 MyD88_L和 MyD88_S变体在 RAW264.7 细胞上的定量平均表达，***p < 0.001。

参考文献

Shizheng Wang, Xiaochen Ma, Zifu Yang, Xiangchun Zhang, Xiaolei Chen, Yuqing Xia, Xueyun Gao,*and Xiaojun Ren*. Dual-Functional Nanocluster Probe-Based Single-Cell Analysis of RNA Splice Variants. Anal. Chem. 2022. DOI: 10.1021/acs.analchem.1c04918