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利用生物正交反应前后分子结构的变化与荧光分子结合可构建新型荧光探针并通过生物正交反应实现对荧光信号的调控。在生物医学应用中，这种生物正交探针可减少来自未反应探针的背景信号干扰，从而实现在活细胞亚细胞器高分辨成像和活体示踪。四嗪因其快速的反应动力学和良好的荧光调控能力，成为最高效的生物正交工具之一。近{attr}3187{/attr}荧光具有自体背景荧光干扰小、穿透深度大、光毒性小等特点。但现有的四嗪荧光探针构建策略大多基于能量转移机理，然而近红外荧光团的S1轨道低于四嗪S1轨道，无法实现对近红外荧光分子的高效淬灭与开启。开发具有荧光高效调控能力的四嗪近红外探针将一直是本领域的挑战。
近日，四川大学吴昊星课题组和新加坡科技设计大学刘晓刚课题组合作，报道了一种新型四嗪近红外荧光探针的构建策略，并通过计算化学解释了设计合理性，揭示了新荧光调控机制。作者团队通过在荧光分子的meso位引入四嗪，构建了一系列四嗪荧光探针。该类新型探针利用光诱导电子转移（PeT）机制，突破了原有设计策略对荧光分子波长的限制，实现荧光高效淬灭，与生物正交反应后，在586–806 nm波长范围内荧光开启倍数可达102–103倍。
首先，研究者对四嗪调控近红外荧光探针的新策略提出猜想：将四嗪与经典近红外荧光分子(如碳罗丹明、硅罗丹明、花菁素等)的meso位用叔胺基相连，一方面大大缩短了四嗪与荧光团的距离，有利于两者强烈的电子相互作用的发生，激活了PeT过程；另一方面，叔氨基相较于仲氨基而言可以防止荧光发射蓝移，提高PeT的效率，从而提高荧光开启比。由于PeT不需要荧光团和四嗪的吸收光谱重叠，研究者利用此设计打破了之前策略中高效调控能力的波长限制。（图一）
图一 四嗪调控近红外荧光探针的新策略 基于以上策略，研究者模块化地合成获得了氧罗丹明、碳罗丹明、硅罗丹明及花菁染料Cy7的meso位修饰的四嗪荧光探针。该系列探针与生物正交亲二烯体反应后，在586–806 nm波长范围内荧光开启倍数可达100–1459倍。其中，花菁类探针(λem = 806 nm) 与BCN反应后的荧光开启比为100倍，比先前的研究高出两个数量级。（图二） 随后，作者通过密度泛函理论计算进一步解释了荧光淬灭机制：对于λem＞700nm的探针，其激发态能级S1低于四嗪的S1能级，故能量不会转移到四嗪的暗态。能量转移暗态致淬灭（ETDS）理论不再适用，但由于四嗪和荧光团的距离近，触发了电子转移过程：荧光团为电子供体，四嗪为电子受体，通过PeT过程实现淬灭。当四嗪与亲二烯体反应后，所产生的哒嗪结构中断了PeT过程，荧光恢复。但对于λem＜700nm的探针，其激发态能级S1接近或高于四嗪的S1能级，ETDS理论仍适用，在ETDS和PeT的共同作用下实现荧光淬灭。 图二 新骨架探针的合成路线及光学性能 研究者在后续研究中发现，这类探针有较高的化学稳定性且光稳定性优于部分商品化荧光探针。研究者利用该探针的优良特性，成功实现了活细胞亚细胞结构的免洗生物成像、活鼠卵巢癌移植瘤成像，均具有优异的分辨率和信噪比。（图三） 图三 免冲洗活细胞、活鼠成像 该工作将四嗪调控荧光染料的波长范围拓展到了近红外800nm区域，将进一步促进四嗪生物正交荧光探针在分子影像学、生物医学等领域的应用。 论文信息： Overcoming the Spectral Dependence: A General Strategy for Developing Far-Red and Near-Infrared Ultra-Fluorogenic Tetrazine Bioorthogonal Probes Wuyu Mao, Weijie Chi, Xinyu He, Chao Wang, Xueyi Wang, Haojie Yang, Xiaogang Liu, Haoxing Wu 第一作者为四川大学毛梧宇博士和新加坡科技设计大学迟伟杰博士。 Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202117386
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