▲ 共同第一作者：张宏霞，田晒校；共同通讯作者：王健博，李延伟（山东大学） 本文通过理论计算和实验相结合的方式，半理性设计氟乙酸脱卤酶RPA1163用于动力学拆分α-氟代羧酸，实现R型α-氟代羧酸和R型α-羟基羧酸克级制备。
有机化合物中氟原子的引入往往能改变有机分子的物理化学性质，增强其生物活性和代谢稳定性，因此有机氟化物在包括制药以及农药化学以内的许多领域中均扮演了非常重要的角色。正因为有机氟化物应用的广泛性，因此如何实现有机氟化物的高效合成特别是如何高效制备含氟手性中心的化合物，一直受到化学家的关注。而手性α-氟取代的羧酸类化合物（α-fluorocarboxylic acids，FCAs）不仅本身即具有的生物活性，而且也可以作为砌块用于合成更加复杂的生物活性分子。因此有关该类化合物的制备也广受关注。目前手性α-氟取代的羧酸类化合物的制备主要通过化学方法合成，然而传统的化学合成方法操作复杂，立体选择性不高，无法避免金属催化剂以及有机溶剂的使用，从而造成环境污染的问题。相对于化学催化，生物催化具有绿色环保，催化效率高，对映选择性好等优点，因此发展生物催化的方法来制备这一类有机氟化物对于整个有机氟化学领域都是一个重要的推动。然而酶本身也具有热稳定性低、底物特异性高，以及针对非天然底物催化效率低等特性，这些缺点严重阻碍了它们的广泛应用。而随着分子生物学技术的发展，基因合成以及测序成本的降低，一系列的方法工具（基因挖矿、定向进化、计算机辅助设计等等）也被开发出来，有效地弥补了这些缺点，全面推动了生物催化在有机化学领域的开发与利用。前期工作中发现氟乙酸脱卤酶RPA1163可以特异催化（S）构型的α-氟代苯乙酸以及α-氟代苯丙酸脱氟水解生成对应的（R）构型的α-羟基苯乙酸和（R）构型的α-羟基苯丙酸，具有手性拆分的潜在用途。但是以前的研究主要集中在研究水解脱氟机理方面，所尝试的底物谱也非常狭窄。本研究首先优化了整个反应条件，发现目标蛋白RPA1163热稳定性极高，即使室温存放10天，都未见明显失活。接着在最适反应条件下拓展了底物谱，针对反应活性较低的底物，运用计算辅助半理性设计氟乙酸脱卤酶，通过定点突变构建的突变体，实验测试显著提高了针对目标底物的活性。进一步测试其它底物发现，对大多数底物的活性均有非常明显的提高。进一步通过计算模拟的方法，揭示了其活力提高的机理，而且所得突变体成功地实现了克级拆分α-氟代羧酸。此工作不仅开拓了氟乙酸脱卤酶新的用途，为合成手性纯的α-氟代羧酸和α-羟基羧酸类化合物提供新思路，而且显示了计算机辅助设计的精确性，为蛋白改造提供了一个强有力的工具。文章首先拓展底物谱，用野生的氟乙酸脱卤酶测试了其针对10个底物的总转化数（TON），（表 1），发现其对绝大多数底物有非常高的转化数。但是其中两个底物的活性差别引起了我们的注意，底物1g和1h均为二氟取代，分子大小一样，但是TON相差76倍。针对这一现象，我们做了以下猜想：1.可能是底物本身的C-F键键能存在差异；2.酶对底物的结合能存在差异；3.反应决速步能垒存在差异。
▼ 表1. 野生型催化各底物的总转化数（TON）以及各底物C-F键异裂解离能
针对猜想1，我们通过计算算出来了每种底物C-F键的裂解能（BDE）。通过BDE数据的比较可以看出，1h的BDE反而低于1g，因此C-F键的强度并不是影响反应活性的决定性因素。针对猜想2，我们测量了所有底物的动力学数据，通过米氏常数Km数据的差异可以看出，1h的Km要低于1g的Km，因此结合能也不是决定反应活性的因素。而在测试动力学时，可以发现1g和1h的kcat相差很大，而这很可能来自决速步能垒的差距。最后为验证第三个推论。我们通过QM/MM计算能量差及Hammett plot表明1h和1g的酶催化托福水解反应存在不一样的决速步，其中1g相对应的两步反应的能垒均低于1h，因此这也导致了RPA1163催化1g的活性要远高于1h。
▼ 表2. 野生型催化各底物的动力学数据
为了提高1h的活性，需要对野生型的RPA1163进行改造。为了降低筛选的工作量，我们采用了计算机辅助设计的方法。首先通过将目标底物1h对接到野生型RPA1163的活性口袋中，分析其5Å以内的氨基酸，排除掉一部分对活性起决定作用的氨基酸后，对反应过渡态进行静电势扫描发现大位阻的氨基酸W185可能是影响活性的关键氨基酸（图 1a），减小W185的大小可能会提高其针对目标底物的活性。所以我们利用计算设计了突变体W185A（图 1b），通过比较过渡态中间体在蛋白中以及在溶液中的键角和二面角的差别，我们观察到W185A的这两个参数相对野生型分别增加20.2°和3.3°，更加接近在溶液中的状态。此外中间体的苯基与H280的咪唑基团的距离也由4.8增加到5.1，长的距离可能减少了π-π相互作用，加速产物的离去。随后考虑到静电作用和氢键等其他相互作用，我们用同样的方式预测了三个突变体（W185S,W185T和W185N）的活性。结果表明，三种突变体相比野生型更适合中间体的展开，其中W185T和W185N所形成的中间体的键角和二面角最接近在溶液中的状态，可以推测W185T和W185N或为最佳突变体。接下来，我们通过定点突变构建了这四个突变体进行体外验证。结果表明，正如我们所预测的，所有突变体都表现出比WT更高的活性，且W185N和W185T为最佳突变体。
▲ 图1 RPA1163活性口袋结合底物1h的关键参数
进一步为了阐明活性增强的机理，我们首先排除结合降低引起活性增加的可能性。通过突变体针对活力较低底物的动力学测试表明（表3.)，两个突变体催化1h或1i转化的Km均保持不变或仅略有增加，而kcat值则显著增加了16倍和19倍，因此结合能再次被证明不是决定因素。进一步通过QM/MM计算证明，突变体显著降低了决速步的能垒（图2）。
▼ 表3. 突变体动力学测试底物1h和1i
▲ 图2 QM/MM计算野生型和突变体催化1h转化的能垒
有趣的是在以前的研究中报道，W185还具有控制底物进入活性口袋和产物从活性口袋释放的功能，因此这一位点的突变有可能加速这两个过程，从而提高反应效率。因此我们对WT、W185N和W185T进行了1000ns的分子动力学（MD）模拟。如图3所示，MD模拟结果表明，与W185N和W185T突变体相比，WT对底物或产物的入口最窄（D1=4.7A，D2=5.8A）。当模拟时间延长到1000ns时，通道变得更加开放（D1=7.6A，D2=8.8A）。相反，在整个1000ns模拟过程中，W185N和W185T突变体的通道更宽，并保持稳定。为了进一步验证底物的结合与产物的释放影响活性，我们测了粘度动力学数据，结果也表明活性在一定程度上受产物释放的影响，但是其主要影响因素依旧是能垒的变化。
▲ 图3 1000 nm 分子动力学模拟考察WT，W185T，W185N通道的变化情况
综合以上结果，该氟乙酸脱卤酶显示了大规模拆分α-氟代羧酸的潜力。因此我们以WT、W185N和W185T的全细胞冻干粉作为生物催化剂，测试了相关十种底物的克级拆分，结果显示所有反应非常高效快速，所有反应均可在7小时内完成，有的甚至只需要1个小时即可结束，产物只需一步硅胶色谱层析纯化即可得到高对应纯的2a-j和3a-j。我们对氟乙酸脱卤酶RPA1163的理化性质进行了重新测试，结果表明其具有很高的热稳定性，具有工业应用所需的关键性能。针对活力较低的底物，我们通过计算机辅助设计策略，挖掘出了一个关键氨基酸，并且经过计算模拟筛选确认了新的活性更高的氨基酸，进一步通过体外活性测试验证了计算模拟的精确性。最后利用野生型和突变体优秀的催化效率，成功实现了α-氟代羧酸的克级拆分。本工作不仅为大规模制备对映体纯α-氟和α-羟基羧酸提供了一种简便的方法，加深了我们对氟乙酸脱卤酶催化C-F活化机制的了解，而且在一定条件下证明了计算模拟辅助设计的精确性，为酶工程改造提供了一条新的借鉴模式。王健博教授课题组成立于2017年7月，目前组内人员包括硕士、博士以及本科生共15人，主要研究方向为生物催化和酶的定向进化。具体情况可以浏览课题组网站：https://www.x-mol.com/groups/wanglab，欢迎各位有志于该方向的同学加入课题组。课题组长期招聘师资博后，有意者可以直接联系课题组长：jwang@hunnu.edu.cnhttps://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.9b04804
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