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便携化现场即时诊断（point-of-care test, POCT）对于疾病早期自诊自检、降低交叉感染、控制疾病传播和节约医疗成本至关重要。但在重大疾病、传染病诊断及食品质量监督等领域，实用化的POCT产品依然严重匮乏。为缩短相关技术原理及装置的研发周期，美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校Yi Lu教授于2011年将血糖仪作为毒品检测的终端信号，首次提出“利用商品化POCT装置进行通用分子检测”的创新研究思路。随后，加拿大麦克马斯特大学Yingfu Li教授和美国得州大学奥斯汀分校Andrew D. Ellington教授等相继实现pH试纸和商品化早孕试纸（即人绒毛膜促性腺激素hCG试纸）等对核酸及非核酸物质的精准分析；证明这一创新思路的确是推进通用POCT检测的有效捷径。然而，待测靶标与现有POCT装置之间的传导方式依然存在一些实用化问题。以早孕试纸条通用检测为例：其高度依赖磁球分离等异相操作，步骤相对繁琐；而操作简单的方法多为“Signal-OFF”的信号模式，易造成结果误判。为此，需要建立更为高效和简便的信号传导机制。
近日，中国科学院长春应用化学研究所李冰凌研究员和杜衍研究员合作，提出了一项名为“CLIPON（CRISPR and Large DNA assembly Induced Pregnancy strips for signal-ON detection）”的创新检测原理；可在免分离的均相溶液中实现商品化早孕试纸对单链和双链核酸序列的“Signal-ON”可视化检测，灵敏度高、选择性强、通用性强，并具有高度灵活的可拓展性和集成性。通过设计专属的图象处理APP和微流控芯片，CLIPON检测可进一步实现定量化和便携化。 图1展示的是CLIPON的标准检测原理，由四个重要的成分组成，分别是：单链DNA-hCG复合探针（NHP）、CRISPR-Cas12a、crRNA和类花椰菜结构的大尺寸核酸基底(CLD)。检测前，NHP探针与CLD上的特征序列杂交，被CLD俘获；由于CLD的尺寸较大，无法进入早孕试纸条（以下简称PTS）；因此PTS上只显示一条红色的“控制线”。当待测序列(target)存在时，其与Cas12a-crRNA复合体中互补的crRNA杂交，激活Cas12a反式切割活性，使NHP中的单链DNA碎片化；被释放的hCG得以进入PTS，在试纸条上呈现出红色的“检测线”。 图1. CLIPON标准检测流程。 CLIPON在设计上具有以下的优点： 1） CRISPR-Cas12a/crRNA系统除了提供高选择性的序列识别功能，还可以实现从待测序列到游离hCG的“一对多”转化，提升灵敏度和信噪比。 2） CLIPON首次选用了环介导恒温扩增（LAMP）的扩增产物作为大尺寸基底材料（CLD）。相比于其他常用的基底材料（磁球、核酸纳米花等），LAMP产物具有产率高、免处理、尺寸大、分散性好、探针杂交位点多等优点。 3） 仅需要更换一个crRNA组分，任意CLIPON体系（NHP, CLD和cas12a）即可用于新序列的精准检测；降低研发的周期和风险。 图2. RPA-CLIPON用于HPV临床样本和RT-RPA-CLIPON用于 SARS-CoV-2假病毒检测。 图3. Duplex Switch-CLIPON用于基于核酸适配体的小分子腺苷检测。 此外，CLIPON还具有较强的功能延展性。例如，上游与重组酶核酸扩增（RPA或RT-RPA）对接，CLIPON可实现对DNA和RNA病原体的超灵敏分析，检测限低至单拷贝/反应。图2展示的是人乳头瘤病毒(HPV-16)和新型冠状病毒（SARS-CoV-2）实际样本的检测结果，检测限低至单拷贝/微升。与核酸适配体开关（Duplex Switch）对接，CLIPON的待测物还可以拓展至小分子等非核酸物质。图3展示的是小分子腺苷的检测结果。值得注意的是，核酸适配体开关在设计上进一步强化了crRNA的通用性，即针对不同的待测分子，仅需要改变红色字体的适配体序列即可。 综上，CLIPON为发展通用POCT检测提供了一个“灵敏、均相、通用和灵活”的创新策略。虽然如此，其整体性能还有较大的优化和改进空间：例如，从“分步”到“一步”的流程简化、图像处理功能优化、与上游恒温扩增体系的进一步集成等。 论文信息： CLIPON: A CRISPR-Enabled Strategy that Turns Commercial Pregnancy Test Strips into General Point-of-Need Test Devices Yidan Tang,Lijuan Qi,Yichen Liu,Lulu Guo,Rujian Zhao,Meiting Yang,Yan Du,Bingling Li 文章的第一作者是中国科学院长春应化所助理研究员唐艺丹博士。 Angewandte Chemie International Edition
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