ACS Nano：适配体自组装的分子工程提高了体内的稳定性和靶向识别

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第一作者：Fangfang Xiaong>

通讯作者：Jianjun Liu，Zeyu Xiao，Weihong Tan

通讯单位：上海交通大学


研究内容：

功能修饰的适配体偶联物是一种很有前途的工具，可用于靶向成像或治疗各种疾病。然而，适体分子在体内的不稳定性限制了其广泛应用。为了克服这一挑战，目前的策略主要依赖于适体的共价化学修饰，这是一个复杂的过程，需要逐案序列设计、多步骤合成和纯化。在此，作者报道了一种共价无修饰的策略来提高适配体的体内稳定性。该策略简单地利用一步分子工程，将适体与金纳米团簇(GNCs)结合，形成GNCs@aptamer自组装。使用Sgc8作为一个代表性的适配子，由此产生的GNCs@Sgc8组合增强了癌症细胞的特异性结合和通过受体介导的内吞途径的顺序内化。重要的是，GNCs@aptamer自组装体抵抗核酸酶降解长达48小时，而单独的核酸适配体降解仅为3小时。与此同时，GNCs@aptamer自组装体的肿瘤靶向识别和保留显著增强，与单独的适配体相比肿瘤内的信号增加了9倍。该策略避免了对适配体进行复杂的化学修饰，可以推广到所有的适配体。我们的工作提供了一个简单、有效和通用的策略，以增强任何适配体或其偶联物的体内稳定性，从而扩大其成像和治疗应用。


 合成示意图


要点一：

作者报道了一种使用GNCs构建稳定适配体组装的无共价修饰策略(Scheme1)。将适配体组装成单分散的NPs取决于负适配体与正适配体之间的电荷相互作用。此外，自组装方法具有通用性;在替换了两个不同的适配体后，得到了与GNCs@Sgc8相似的结果。重要的是，与Sgc8适配体相比，GNCs@Sgc8组装体对血清核酸酶具有很强的抗性，并能够在结合同源目标后以高亲和力保持构象稳定性。透射电镜(TEM)显示GNCs呈球形，尺寸分布均匀(图1)用20个纳米颗粒测量得到的GNCs直径为 2.42±0.49 nm。由于GNCs表面CR9的存在大于GSH所携带的负电荷，导致GNCs的正电荷(23.8 mV，图1 f)。作者发现GNCs与Sgc8的任何比例(RAu/Sgc8 = 1:1, 14:1, 17:1)都能形成GNCs@Sgc8组件(图1b−d)。


要点二：

作者之前报道过Sgc8 aptamer可以特异性识别和结合膜蛋白PTK7，该蛋白在许多癌细胞中过表达，如CEMC - CCRF急性白血病(CEM)细胞和大肠癌HCT-116细胞。因此，作者选择了适配体Sgc8作为靶向配体。通过荧光强度检测(图2a)，自组装的GNCs@Sgc8与Sgc8适配体相比，对HCT-116细胞的结合能力增强，说明Sgc8与GNCs自组装后的结合能力没有受到影响，反而增强了。当作者通过共聚焦显微镜评估GNCs@Sgc8的结合能力时，与其他适配子或序列相比，GNCs@Sgc8-treated HCT-116细胞的荧光强度最高，这意味着GNCs@Sgc8具有良好的靶向能力(图2b−d)。这一现象与流式细胞仪检测结果一致，再次证实了GNCs@Sgc8 的选择性靶向能力PTK7 +癌细胞。值得注意的是，GNCs@Sgc8与PTK7蛋白的结合亲和力是Sgc8的1.5倍(图2e)。

要点三：

作者为了考察稳定性，将McCoy含20%胎牛血清的5A培养基与Sgc8和GNCs@Sgc8孵育。琼脂糖凝胶分析结果如图3a所示。3 h后Sgc8部分降解，12 h后完全消失，可以清楚地看到Sgc8的运动，而GNCs@Sgc8对照在琼脂糖凝胶中保持良好。与Sgc8相比，GNCs@Sgc8的电泳迁移率较弱，自组装的纳米粒子在电泳力作用下位于较好的位置。图3b进一步表明GNCs@Sgc8组装体有效地保护了Sgc8不被核酸酶快速降解。稳定性的显著提高可能是由于Sgc8的一部分在颗粒内部凝聚，从而限制了与核酸酶的接触。作者通过对小鼠的对比实验发现GNCs@ 68 GaNOTA -Sgc8在1 h的肿瘤与肌肉对比最高(16.6:1)，最后，已经证明GNCs@Sgc8可以保护Sgc8不受核酸酶的影响，从而阻止其降解。

    

图1：GNCs和GNCs@Sgc8组件的表征。(a) GNCs的TEM图像。(b−d) GNCs@Sgc8按不同比例组装的TEM图像。R Au/Sgc8分别为1:1、14:1、17:1。(e)不同样品的DLS表征。(f) GNCs, Sgc8和GNCs@Sgc8的Zeta电位。


图2:GNCs@Sgc8的结合能力。(a) 流式细胞分析。(b-d) 不同材料的细胞共聚焦成像。(e) Sgc8和GNCs@Sgc8对PTK7蛋白的结合亲和力。


图3：(a) Sgc8和GNCs@Sgc8的稳定性和体内分布。(a) 用琼脂糖凝胶(1%)测定Sgc8和GNCs@Sgc8在McCoy的添加20%胎牛血清的5A培养基中的降解情况。(b) 不同浓度的Dnase I处理适配体的稳定性分析，1%琼脂糖凝胶经GelRed染色。(c) Sgc8 GNCs@Sgc8在不同时间间隔的PET/CT图像。红色虚线表示肿瘤区域。

 

参考文献

F. Xia, A. He, H. Zhao, Y. Sun, Q. Duan, S.J. Abbas, J. Liu, Z. Xiao, W. Tan, Molecular Engineering of Aptamer Self-Assemblies Increases in Vivo Stability and Targeted Recognition, ACS Nano, (2021) DOI: 10.1021/acsnano.1c05265.


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