今天为大家分享一篇发表在Angew上的文章，文章的题目是“Supernova: a {attr}3220{/attr}oxyribozymethat catalyzes a chemiluminescent reaction”，通讯作者是来自捷克科学院的Edward Curtis教授，他的实验室主要研究功能性RNA和DNA。在这篇文章中作者筛选得到了一种可以催化化学发光{attr}3130{/attr}的DNA核酶。

      20世纪80年代核酶被发现以来，已经有多种具有催化能力的RNA和DNA分子被报道，他们被广泛应用于包括插入特定序列、检测生物小分子如ATP在配体存在下产生荧光信号等方面。在生物传感器中，光信号具有便宜好用、安全性高等特点，作者因此希望开发一种可以催化产生光信号的核酶系统。作者注意到一种基于1,2-二氧乙烷结构的发光小分子CDP-Star，其发光基团被磷酸基封闭，当磷酸基去除后则会产生光信号。CDP-Star被广泛应用于磷酸酶的检测中，在之前的研究中，已经报道了可以催化磷酰转移的核酶，因此作者认为通过核酶发生自磷酸化，从而转移掉CDP-Star的磷酸基使其发光的思路是可行。

      作者首先对能转移CDP-Star磷酸基的核酶进行了筛选。作者首先将1016个单链DNA分子与CDP-Star共孵育，然后通过T4连接酶在DNA的5`端连接上用于后续PCR的引物。由于T4连接酶不能识别5`端羟基的DNA，因此在这一步中只有能转移磷酸基的DNA会被连接上引物。作者随后通过PAGE纯化、PCR、磷酸外切酶得到了目标DNA，其5`端磷酸可以被水解酶再生，用于下一轮的筛选。经过9轮筛选后，作者得到了一系列具有高催化活性的克隆。

      为了进一步提高催化活性并了解催化活性与序列的关系，作者进一步使用了人工进化的方法。作者通过化学合成，在每个位置以21%的概率生成随机突变，最终生成了约135000个不同的脱氧核酶。这些脱氧核酶相比于最初的核酶具有高6倍的催化速率，且它们的序列中有3段高度保守的序列。序列对比显示出这些脱氧核酶具有一个独特的三螺旋结构，而该结构又被一个四碱基三联体结构固定。随后作者对缓冲液中金属离子的影响进行研究，结果证明该催化过程还需要锌离子参与，作者推测其催化机理与碱性磷酸酶类似。

      最后作者对这套系统的发光能力进行了研究。结果显示只需要~10 nM的底物CDP-Star就可以产生光信号，而该信号的线性范围则横跨1 uM到3000 uM，且对底物特异性很高。另外作者还检测了该系统的应用价值，作者首先将其应用在了对特定序列核酸的检测上，通过在脱氧核酶的可变区和3`端添加用于检测的互补序列，作者成功实现了对特定序列的定量检测。

      综上所述作者通过筛选和人工进化的方法，开发了一套包含脱氧核酶和CDP-Star的化学发光系统，并将其应用在了特定核酸的检测中。该方法具有成本较低、易于改造等优点，作者相信它会在传感器或DNA逻辑电路中发挥重要作用。

本文作者：LYP

责任编辑：Guo ZH

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202109347

原文引用：DOI：10.1002/anie.202109347