为大家介绍的是最近在Nat. Comm.上报道的一篇标题为 “An amphipathic peptide with antibiotic activity against multidrug-resistant Gram-negative bacteria” 的文章。该文的通讯作者是澳大利亚昆士兰大学分子生物科学研究所的Matthew A. Cooper教授，其主要研究抗超级细菌药物。Matthew A. Cooper教授等人在本文中报道了一种两亲性抗菌肽的结构导向优化，设计产生了在体外具有广谱抗菌活性且在体内、外显著改善细胞毒性和溶血性的新型抗菌肽。

多重耐药（Multidrug-resistant, MDR）是革兰氏阴性菌流行的重要原因。革兰氏阴性菌拥有外排泵、孔蛋白和抗生素不可渗透膜，它们共同降低了细胞质中的药物浓度，从而影响了药物对细胞质内抑菌作用靶点的控制。最新发现的多重耐药性细菌有携带有NDM-1基因的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等。

抗菌肽（Anti-microbial peptides, AMPs）是一类分子多样性高的、可人工合成的抗生素，但它们通常是阳离子的，具有高细胞毒性、肾毒性和/或耳毒性，这极大限制了其临床应用。

Arenicin-3是从海洋多毛夜蛾体腔细胞中分离得到的一种两亲性抗菌肽。它包含两个二硫键，形成了一个具有21个残基的β-发夹。它在体外对各种多重耐药和广泛耐药的致病性革兰氏阴性菌表现出高效的抗菌活性，但它也有细胞毒性，并会诱导人红细胞溶血。为了提高Arenicin-3的性能，Matthew A. Cooper教授等人力图通过结构优化设计，提高其抗革兰氏阴性菌活性，同时尽量其减少毒性。

首先，作者通过核磁共振观察了Arenicin-3的三维结构。Arenicin-3是由两个β链（Cys3-Asn10和Arg13-Cys20）通过I型β-转弯（Asn11/Gly12）连接后组成反平行β折叠片。并且β折叠片由两个刚性二硫键桥Cys3-Cys20和Cys7-Cys16稳定。利用这些结构数据，作者设计、合成和表征了一系列Arenicin-3类似物，并评估了它们的活性、毒性和膜选择性。为保持肽主链的完整性和抗菌活性所需的二级结构，Cys没有参与突变设计。

图1. Arenicin-3的三维结构示意图，其中黄色表示二硫键

通过肉汤微量稀释法，作者测定了Arenicin-3和一系列衍生物对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及酵母菌的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration, MIC）。其中有抗菌活性的Arenicin-3变体被进一步用于表征对大肠杆菌参考菌株ATCC 25922和新型多重耐药菌肺炎克雷伯菌BAA-2146菌株的抗菌活性。相比天然Arenicin-3，Arenicin-3变体对这些菌株的抗菌活性提高了2到16倍。

图2. Arenicin-3及其变体的抗菌活性

值得注意的是，多肽的亲脂性、电荷和两亲性等会对抗菌活性和细胞毒性造成影响。如替换或删除Arg18和Arg19会显著降低抗菌活性；将Val残基（Val6, Val8, Val13, Val15）替换为Ala有利于抗菌活性的提高。

而亲脂性是改善多肽的细胞毒性的关键。用His替代Tyr17可降低细胞毒性；用更亲脂的残基交换Tyr5、Val6、Val13和Val15，并用更亲水的残基交换Val8、Tyr9和Tyr17，可实现降低细胞毒性的同时保持抗菌活性。在Arenicin-3变体中，AA139在体内模型中显示出了良好的疗效，并且与天然Arenicin-3相比，它降低了对哺乳动物的毒性。

图3. Arenicin-3及其变体的细胞毒性

为了研究Arenicin-3的作用方式，作者还进行了膜结合与渗透，细胞ATP释放情况，以及通过转座子定向插入测序（Transposon directed insertion sequencing, TraDIS）对靶向磷脂转运的表征。结果表明，Arenicin-3首先直接与细菌外膜中的磷脂相互作用，干扰膜的稳态、诱导膜通透性和ATP释放，并在连续传代中导致磷脂转运基因mlaC的突变。

以上结果表明，Matthew A. Cooper教授等人通过对两亲性抗菌肽Arenicin-3的结构导向设计，成功优化了其抗革兰氏阴性菌活性，同时显著降低了其对体外人细胞和哺乳动物体内的毒性。在深入研究中，作者发现Arenicin-3的作用机制主要是与磷脂的相互作用以破坏细菌膜结构，以及诱导磷脂转运基因mlaC的突变。但是需要注意的是，即使使用Arenicin-3优化变体对小鼠全身给药，剂量达到一定程度，小鼠会表现出嗜睡、运动减少、四肢肿胀、颤抖和抽搐等副作用。看来，人类和“超级细菌”之间的战火硝烟，不会这么快就平息。

作者：SJL 审校：LJH

DOI: s41467-020-16950-x

Link: http://www.nature.com/articles/s41467-020-16950-x