姜黄素（curcumin，Cur）为一种提取于天然植物的酚类物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗纤维化等药理作用^[1-10]，且因其资源丰富，价格低廉，毒副作用小，而极具开发应用前景。但Cur溶解度低、稳定性差、体内代谢和排泄迅速^[11-13]，大大限制了其临床应用。胡椒碱（piperine，Pip）来源于天然植物胡椒，具有良好的安全性，可抑制多种药物代谢和转运酶的活性^[14-16]，从而提高一些治疗药物和植物化学物质的生物利用度。当其与Cur以一定比例联用时，不仅可通过与Cur的烯醇质子形成分子间氢键来抑制Cur的堆叠倾向从而增加其溶解度，而且其双键共轭网络和多电荷中心提供了与许多酶（UDP-GDH、CYP3A4、UGT等）结合的最佳结合位点，从而抑制引起Cur代谢、排泄的酶，增加其生物利用度^[17]，增强疗效^[18-22]。姜黄素-胡椒碱固体分散体（Cur-Pip SD）有效地改善了Cur和Pip的体外溶出度以及生物利用度^[23]。

聚合物胶束（polymeric micelles，PM）是由两亲性聚合物在水性介质中自组装形成的纳米级壳核结构，其疏水性内核装载药物，具有增加药物的溶解度、缓释药物、降低药物被网状内皮系统识别和摄取的概率^[24-26]等优点。本研究选用三嵌段共聚物普朗尼克（Pluronic）为载体材料，它由两端的亲水链聚氧化乙烯（PEO）和中间的疏水链聚氧化丙烯（PPO）构成，具有毒性低、免疫原性弱及生物相容性好的优点。应用此类材料制备的载药胶束粒径通常小于100 nm，因此能增强被装载药物在病灶组织的滞留蓄积^[27]。此外，普郎尼克还能通过抑制P糖蛋白等机制逆转肿瘤细胞的多药耐药性^[28]。因此选用普郎尼克为载体材料装载Cur与Pip，制备姜黄素-胡椒碱聚合物复方胶束（Cur/Pip F127/P123- PM），通过聚合物胶束与Pip的双重作用提高Cur的溶解度与生物利用度，从而更好地发挥Cur的药理作用。本研究使用的星点设计-效应面法（CCD- RSM）是一种集数学与统计为一体的实验设计和优化方法，与正交设计、均匀设计相比，其精度更高，预测性更好，可用于非线性模型的拟合，近年来已被广泛用于处方筛选和工艺优化。本研究以Cur包封率和载药量、Pip包封率以及胶束平均粒径为评价指标，考察处方中主要因素对制剂的影响，预测最优处方。

1  材料

1.1  仪器

Acquity UPLC色谱仪，包括四元高压泵系统，自动进样器，在线脱气系统，PDA检测器，Empower 3.0化学工作站，美国Waters公司；JPCQ1028型数控超声波清洗机，武汉嘉鹏电子科技有限公司；Standby SartoriusME/SE系列微量电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；Milli-Q纯水系统，美国Millipore公司；HJ-4D数显恒温测速磁力加热搅拌器，江苏省金坛市友联仪器研究所；GAOKE旋转蒸发仪，巩义市英峪高科仪器厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；DZF-6020型真空干燥箱，宁波江南仪器厂；SHA-B水浴恒温振荡器，常州市国旺仪器制造有限公司；Sigma4-15低温冷冻离心机，Sigma公司；Zetasizer Nano Series纳米粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；Modul Yod-230真空冷冻干燥仪，Thermo Fisher公司；H-7650透射电子显微镜，日本日立公司。

1.2  试药

对照品Cur（批号110823-201706，质量分数98.7%）、Pip（批号110775-201706，质量分数98.9%），中国食品药品检定研究院；Cur，批号RS19B301，质量分数98.0%，上海瑞永生物科技有限公司；Pip（批号I1720085，质量分数97.0%），Aladdin公司；P123（批号MKBQ0305V）、F127（批号SLBL1780V），Sigma公司；甘露醇，Amresco公司；乙腈，色谱纯，天津市大茂化学试剂厂；甲醇、二氯甲烷、丙酮、无水乙醇为分析纯；水为超纯水。

2  方法与结果

2.1  Cur/Pip F127/P123-PM与F127/P123-PM的制备

分别称取一定量Cur、Pip、F127、P123于50 mL圆底烧瓶中，加入适量有机溶剂，搅拌溶解（1 000 r/min，5 min），40 ℃旋转蒸发并真空干燥过夜以挥干有机溶剂并形成干燥药膜，后加入适量超纯水，恒温震荡1 h（37 ℃，100 r/min），4 500 r/min离心15 min后取上清，即为复方胶束制剂Cur/Pip F127/ P123-PM。

空白胶束（F127/P123-PM）为不加Cur与Pip，其余同Cur/Pip F127/P123-PM的制备过程。

2.2  色谱条件

采用Waters BEH C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；检测波长：430 nm（Cur）、343 nm（Pip）；流动相为乙腈；体积流量0.15 mL/min；柱温30 ℃；进样量1 μL。在该条件下理论塔板数大于3000，分离度大于1.5。

2.3  Cur载药量、包封率以及Pip包封率的测定

精密量取Cur/Pip F127/P123-PM溶液0.2 mL于10 mL棕色量瓶中，氮吹去除水分，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得Cur/PipF127/P123-PM供试品溶液。按“2.2”项下色谱条件进样分析，色谱图见图1，Cur与Pip 2峰的分离度（R）大于1.5，空白胶束在Cur及Pip处无干扰，专属性良好。将所得峰面积带入线性方程计算Cur/PipF127/P123-PM中Cur与Pip的含量。

Cur载药量＝胶束中Cur含量/(胶束中Cur含量＋载体材料量)

Cur包封率＝胶束中Cur含量/投入Cur的量

Pip包封率＝胶束中Pip含量/投入Pip的量

2.4  单因素考察

2.4.1  F127与P123的比例  固定载体材料的应用总量为200 mg；Cur与Pip的投药量分别为15.00、0.75 mg；有机溶剂种类为二氯甲烷，有机溶剂与水化体积均为5 mL，其他条件同“2.1”项下，考察F127占载体材料的质量比分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9时对Cur包封率和载药量的影响。结果显示，随着F127比例的增大，Cur的载药量和包封率均呈现先缓慢增加后降低趋势。将0.1～0.9的F127质量比作为待优化项进行星点设计-效应面法实验。

2.4.2  投药量 固定载体材料F127与P123均为100 mg；有机溶剂种类为二氯甲烷；有机溶剂与水化体积均为5 mL，其他条件同“2.1”项下，考察Cur与Pip的投药量分别为5.00、0.25 mg，10.00、0.50 mg，15.00、0.75 mg，20.00、1.00 mg，25.00、1.25 mg时对Cur包封率和载药量的影响。结果显示，随着投药量增加，Cur包封率逐渐降低，载药量先升高后降低，将该范围的投药量设为待优化项进行星点设计-效应面法实验。

2.4.3  有机溶剂种类  固定载体材料F127与P123均为100 mg；Cur和Pip投药量分别为15.00、0.75 mg；有机溶剂与水化体积均为5 mL，其他条件同“2.1”项下，考察有机溶剂分别为甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、丙酮时对Cur包封率和载药量影响。结果显示，使用丙酮为有机溶剂时，Cur的包封率与载药量最高，因此选用丙酮进行后续星点设计-效应面法实验。

2.4.4  有机溶剂用量  固定载体材料F127与P123均为100 mg；Cur和Pip投药量分别为15.00、0.75 mg；有机溶剂种类为丙酮；水化体积为5 mL，其他条件同“2.1”项下，考察有机溶剂体积分别为5、10、15、20、25 mL时对Cur包封率和载药量的影响。结果显示，有机溶剂用量对Cur的包封率和载药量的影响均不明显。因此固定有机溶剂用量为5 mL进行星点设计-效应面法实验。

2.4.5  水化体积 固定载体材料F127与P123均为100 mg；Cur和Pip投药量分别为15.00、0.75 mg；有机溶剂种类为丙酮；有机溶剂用量为5 mL，其他条件同“2.1”项下，考察水化体积分别为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL时对Cur包封率和载药量的影响。结果显示，随着水化体积增大，Cur的载药量和包封率均先增加后降低。将2.5～12.5 mL的水化体积作为待优化项进行星点设计-效应面法实验。

2.5  星点设计-效应面法优化处方

以单因素实验结果为依据，进一步采用星点设计-效应面法优化制剂工艺。选取投药量（X₁）、F127所占质量比（X₂）、水化体积（X₃）3个因素，每因素设5个水平（代码值分别为−1.732、−1、0、+1、+1.732）。以Cur载药量（Y₁）、Cur包封率（Y₂）、Pip包封率（Y₃）以及胶束粒径（Y₄）为考察指标进行3因素，5水平的星点设计-效应面法实验，代码值所代表的实际物理量及实验安排和结果见表1。

利用Design-Expert10.0.3统计软件对表1数据进行统计处理，并获得Y₁、Y₂、Y₃、Y₄值对自变量X₁、X₂、X₃的多元线性回归方程、2项式拟合方程以及3项式拟合方程。通过比较3种拟合方程的P值与相关系数（R²）发现各考察指标与因素之间均为2项式方程的拟合效果最好，各考察指标的2项式拟合方程如下：Y₁＝6.01＋1.58 X₁－1.56 X₂＋0.20 X₃－2.59 X₁X₂＋0.28 X₁X₃＋0.22 X₂X₃－3.45 X₁²－1.88 X₂²－0.99 X₃²，P＜0.000 1，r²＝0.969 5；Y₂＝83.45－14.07 X₁－20.49 X₂＋7.08 X₃－37.08 X₁X₂－0.48 X₁X₃－0.48 X₂X₃－15.78 X₁²－24.23 X₂²－8.41 X₃²，P＜0.000 1，r²＝0.935 5；Y₃＝80.16－5.51     X₁－0.33 X₂＋1.49 X₃－3.37 X₁X₂＋1.69 X₁X₃＋4.16 X₂X₃－21.63 X₁²－27.92 X₂²－21.16 X₃²，P＝0.011 2，r²＝0.811 6；Y₄＝65.22＋13.41 X₁－13.17 X₂＋3.82 X₃－25.26 X₁X₂＋11.64 X₁X₃＋15.10 X₂X₃＋1.12  X₁²－6.38 X₂²－14.64 X₃²，P＝0.001 1，r²＝0.886 4。 

各方程的方差分析结果见表2、3。以P＜0.05为有显著性差异，则4个模型均具有显著性差异，能较好反映因素对响应值的影响。进一步分析各方程中的各项，X₁、X₂、X₁X₂、X₁²、X₂²、X₃²对Y₁有显著性影响；X₁、X₂、X₃、X₁X₂、X₁²、X₂²对Y₂有显著性影响；X₁²、X₂²、X₃²对Y₃有显著性影响；X₁、X₂、X₁X₂、X₂X₃、X₃²对Y₄有显著性影响。

利用Design-Expert 10.0.3软件的Analysis模块绘制因素间交互作用有显著性差异的因素对考察指标：即X₁、X₂对Y₁；X₁、X₂对Y₂；X₁、X₂对Y₄；X₂、X₃对Y₄的三维效应面图和等高线图（另1因素设为中心值），结果见图2。

综合考虑胶束制剂的考察因素和图2给出的最优区域，限制考察指标Y₁、Y₂、Y₃为尽量大，Y₄为尽量小，继续应用Design-Expert 10.0.3软件的Optimization模块叠加各模型所得的最佳条件范围得到最终的最优处方：Cur与Pip的投药量分别为12.96 mg和0.69 mg、F127的质量比为0.46、水化体积为8.85 mL。预测在此条件下制备的Cur/Pip F127/P123-PM的Cur载药量与包封率分别为5.59%、88.03%，Pip包封率为78.78%，平均粒径为62.17 nm。

2.6  最优处方的验证试验

以上述最优处方条件制备3批Cur/Pip F127/P123-PM，测定Cur载药量、包封率，Pip包封率以及胶束粒径，结果见表4。Cur平均载药量为5.63%、平均包封率为86.86%、Pip平均包封率为77.54%、胶束平均粒径为66.79 nm，实测值与预测值的误差均小于5%，实验预测性较好，且5个考察指标的RSD值均较小，工艺重现性较好。

2.7  冻干制剂的制备

按最优处方制备胶束制剂，分装于5 mL西林瓶中，每瓶1 mL，分别向胶束制剂中加入1%、2%、4%、8%、16%甘露醇，空白组不加保护剂。通过冷冻干燥法制备冻干制剂，观察各组制剂的冻干效果，将所得冻干制剂保存于4 ℃，30 d后加入1 mL去离子水复溶，纯化水稀释50倍后，采用马尔文纳米粒度仪测其平均粒径，多分散指数（PDI）及平均Zeta电位，考察不同用量甘露醇对胶束制剂的保护作用。结果表明，当保护剂的加入量大于8%时，冻干粉外观无皱缩塌陷现象，呈现色泽均一的明黄色，加入去离子水后能在1 min内迅速溶解为透明溶液，24 h内无沉淀析出。将各组冻干制剂复溶后观察粒径及Zeta电位变化发现，随保护剂的用量增加，胶束平均粒径增加，而PDI与Zeta电位绝对值几乎无变化。冻干制剂平均粒径、PDI及Zeta电位变化结果见表5。综合考虑，选用8%甘露醇为冻干保护剂。

空白及载药胶束制剂冻干前后粒径及Zeta电位图分别见图3、4。由图可初步判断，以8%甘露醇为保护剂时，冻干操作对胶束制剂的质量影响较小。采用透射电镜观察载药胶束及其冻干制剂的微观形态见图5，由图可知胶束制剂成球形，表面较光滑，且分散均匀，无粘连现象。冻干操作对胶束制剂的影响较小。

3  讨论

目前，Cur与Pip混合制剂中Cur与Pip含量的共分析方法常见HPLC法^[29-30]，流动相中往往含有较大比例的水。但本实验使用的普郎尼克载体材料在水中会自组装成具有疏水核的壳核结构，若Cur与Pip包裹在输水核内将影响两者在色谱柱中的保留，因此本实验选用纯乙腈为流动相。为了达到良好分离的效果，采用分离效果更好的UPLC法，并通过降低体积流量的方法增加Cur与Pip色谱峰的分离，最终使2峰的分离度大于1.5，可用于两者的含量测定。

本研究以Cur载药量和包封率为评价指标，通过单因素实验筛选出影响较大的3个因素，并进一步以Cur载药量及包封率、Pip包封率以及胶束粒径为指标，通过3因素5水平的星点设计-效应面法优化得到最终处方。处方验证试验证实，该最优处方对Cur与Pip的包封率均较高，胶束制剂中Cur质量浓度可达1.27 mg/mL，与原料药相比，溶解度显著提高。以8%甘露醇为保护剂得到的冻干产品在4 ℃条件下储存30 d后仍具有较好复溶效果，解决了普郎尼克胶束制剂储存稳定性差的问题。

综上，本研究在建立同一色谱条件下同时检测复方Cur胶束中Cur与Pip含量的UPLC法的基础上，进一步通过单因素实验与星点设计-效应面法实验优化得到Cur/PipF127/P123-PM的最优处方。该胶束制剂成功包载了Cur和Pip 2种药物，且包封率较高，粒径在100 nm左右，其冻干制剂稳定性增加，复溶效果良好，为相关Cur复方制剂的研究提供了基础。

参考文献（略） 

来  源：梁宇飞，张欣欣，许  洁，赵丽艳，李亚鑫，张万明，张丹参. 星点设计-效应面法优化姜黄素-胡椒碱聚合物复方胶束的处方工艺研究 [J]. 中草药, 2020, 51(1):43-50.