J.Am.Chem.Soc.: I型脂肪酸合酶介导的化学酶法合成磷脂膜

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引言

所有活生物体都有磷脂膜来控制物质与细胞外基质的交换，这能够分离并保护敏感的化学反应，并维持细胞内部的平衡。此外，细胞需要磷脂来参与能量产生、膜蛋白合成和细胞信号转导。磷脂通常是由膜结合的酰基转移酶酶促生成的，是肯尼迪脂质合成途径的一部分。这些生化反应所需的{attr}3110{/attr}又由脂肪酸合酶（FAS）制成。FAS是普遍存在的蛋白质，通过酶促功能的模块化和使用载体介导的底物穿梭，以高效的方式催化脂肪酸的合成。从磷脂合成的生化途径中汲取灵感，已有研究设计了自下而上构建磷脂膜的策略。尽管最近的研究表明，磷脂可以通过化学偶联反应以非生物的方式生成，但烷基链通常是外部预先合成的。当前，尚无已知的仿生策略能通过原位形成的脂肪酸尾巴与单链两亲物偶联从头合成磷脂。


成果简介

加州大学圣地亚哥分校的Michael D. Burkart教授和Neal K. Devaraj教授近日在J. Am. Chem. Soc.上共同发表了一篇题为“Chemoenzymatic Generation of Phospholipid Membranes Mediated by Type I Fatty Acid Synthase”的研究论文。在这项工作中，作者采用细菌I型FAS（cgFAS I）结合天然化学连接（NCL），从简单的水溶性脂肪酸前体自发生成膜形成合成磷脂（图1）。这一种化学酶法可以从头开始形成膜，即在无预先存在的膜的情况下形成膜。化学酶促磷脂的形成可提供更简单的策略，以在合成细胞中产生膜区室，支持重组膜蛋白的方法的发展，并促进天然和非规范脂质的合成。


图文解读

图1 FAS介导的化学酶促磷脂合成的示意图。细菌I型FAS使用乙酰基-CoA，丙二酰-CoA和NADPH原位合成棕榈酰-CoA 1。随后通过天然化学连接（NCL）与半胱氨酸修饰的溶血磷脂2反应形成磷脂3，其自发地自组装成膜结合的囊泡。


图2 由细菌I型FAS（cgFAS）介导的棕榈酰-CoA 1的原位合成。作者首先为原位形成活化脂肪酸确定了合适的FAS。II 型FAS由多种酶协同作用组成，而I型FAS由具有催化结构域的单个多酶复合物组成，它们相互协作以形成脂肪酸。I型FAS将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A以化学计量形式产生中链脂肪酸（图2A）。图2A为迭代脂肪酸延伸周期的示意图。丙二酰基-棕榈酰基转移酶（MPT）将最终的棕榈酰基部分转移至CoA分子以形成1[AT：酰基转移酶；ACP：酰基载体蛋白；KS：酮合酶；KR：酮还原酶；DH：脱水酶；ER：烯酰还原酶]。N端His 6标记的I型cgFAS在大肠杆菌中表达，并通过采用先前报道的程序进行纯化。使用快速蛋白质液相色谱（FPLC）色谱柱上的尺寸排阻色谱（SEC）验证了蛋白质的完整性及其寡聚状态（图2B）。然后对这些馏分进行烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）消耗测定，以验证cgFAS活性（图2C）。与以前的报告一致，观察到棕榈酰辅酶A 1是cgFAS催化反应的主要产物。脂肪酸甲酯（FAME）形成后，使用气相色谱质谱（GC-MS）联用技术（图2D），观察到1占形成的总脂肪酸种类的93％。


图3 为了确定非经典磷脂3形成膜结合囊泡的能力，进行了显微镜研究。棕榈酰辅酶A 1和溶血磷脂2均未在水溶液中形成膜。水合时，磷脂3易于形成膜结合的组件（图3）。最初通过相差（图3A）和荧光显微镜使用膜染色染料BODIPY-FL DHPE（图3B）鉴定脂质囊泡。在磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，37°C下将3 水化和搅拌1 h后，观察到直径为1-10 μm的囊泡。透射电子显微镜（TEM）也证实了囊泡结构的形成（图3C）。通过在高极性荧光染料8-羟基-1,3,6-三磺酸（HPTS）存在下3的脂质薄膜水合来证明磷脂囊泡的包封能力，然后通过使用荧光显微镜对囊泡进行表征（图3D）。


图4 表征了各个酶和化学反应的特征后，作者接下来探索了在一锅法反应中将酶促棕榈酰-CoA 1合成与化学磷脂3合成相结合的过程（图4）。简而言之，作者将溶血磷脂2（400 μM）添加到pH 7.4的10 mM磷酸盐（Na2HPO4 / NaH2PO4）缓冲液中，其中含有cgFAS I（1 μM），乙酰-CoA（1 mM），丙二酰-CoA（1 mM），NADPH（10 mM）和=与TCEP（10 mM）。使用HPLC-MS-ELSD测量来跟踪磷脂的形成。反应条件的优化使通过cgFAS I生成的1和2能够快速偶联。一锅反应在30分钟内提供了相应的磷脂3作为主要产物（图4A）。所有溶血磷脂2在不到4小时内被消耗（图4B），得到367 μM磷脂3。反应30分钟后，使用BODIPY-FL DHPE通过荧光显微镜检测了小的囊泡结构。使反应在37°C搅拌过夜后，我们观察到直径在1-2μm的较大囊泡（图4C）。通过BODIPY-FL DHPE的荧光显微镜观察，在37°C下，囊泡在48小时内是稳定的(图4D)。

总结与展望

本工作中，作者开发出一种化学酶法从水溶性前体合成非经典磷脂。 这一方法可以灵活地使反应中产生的脂质种类多样化。文中利用cgFAS I选择性地生成棕榈酰辅酶A，如果使用其他生物脂肪酸合酶也可以形成多种多样的脂肪酰基辅酶A，随后可以将其与反应性溶血磷脂偶联以产生多种种非经典脂质。例如，已知许多细菌中的FAS可以从支链的短链羧酸前体（如甲基丙二酰-CoA）合成末端支链的异构、反异构或ω-脂环族脂肪酸。作者希望利用各种磷脂物种的原位合成，以促进对脂质膜组成如何影响囊泡组装、生长和分裂的研究。


作者简介

Michael D. Burkart 教授

http://burkartlab.ucsd.edu/
教育经历
美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院，美国国立卫生研究院化学生物学Christopher T. Walsh教授课题组博士后（1999-2002）
博士 加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所有机化学专业（1994年至1999年）博士。论文题目：“碳水化合物修饰酶的机理研究与合成使用。”研究顾问：Chi-Huey Wong教授
B.A. 得克萨斯州休斯敦莱斯大学化学博士学位（1990-1994）研究顾问：George J. Schroepfer教授和Kenton H. Whitmire教授
工作经历
加利福尼亚大学圣地亚哥分校拉霍亚分校化学与生物化学专业教授（2012年至今）
圣地亚哥藻类生物技术中心副主任（2010年至今）
化学与生物化学副教授（2008年至2012年），化学与生物化学助理教授 生物化学（2002-2008）
波士顿哈佛医学院，MANIH博士后研究员（1999-2002）
斯克里普斯研究所，加利福尼亚州拉荷亚，研究生研究员（1995年至1999年）
德克萨斯州休斯敦莱斯大学本科生研究助理（1994-1995）
哥斯达黎加圣何塞国家生物多样性研究所（INBio），本科生研究助理（1993）
德克萨斯州休斯敦莱斯大学本科生研究助理（1991-1993）


 

Neal K. Devaraj教授
https://www.devarajgroup.com/
Neal K. Devaraj教授在加州曼哈顿海滩长大，后来离开西海岸到麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology)攻读本科学位，并获得了化学和生物学的双学士学位。在James Collman教授(古根海姆研究员1977年和1985年)和Christopher Chidsey的指导下，获得了斯坦福大学化学博士学位。在哈佛大学医学院(Harvard Medical School)从事博士后研究后，他加入了加州大学圣地亚哥分校(University of California, San Diego)的化学与生物化学学院。他的工作获得了2016年国家费森尤斯奖、2017年美国化学学会纯化学奖的认可，并被选为2018年布拉瓦特尼克国家化学奖得主，以及2019年礼来生物化学奖。为了表彰他对教学的贡献，德瓦拉吉博士被授予2016卡米尔·德莱弗斯教师奖学金(Camille Dreyfus Teacher-Scholar)。


文献链接

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c02121?ref=pdf


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