N⁶-甲基腺苷(m⁶A)修饰是哺乳动物mRNA主要的修饰方式，其是由脱甲基酶和甲基转移酶调控的动态过程，在基因调控中起着至关重要的作用，包括调控mRNA的翻译效率、稳定性和剪接。m⁶A修饰在mRNA特定位点的改变与多种疾病相关，如癌症、心血管疾病和神经系统疾病。然而，由于技术限制，m⁶A功能的探索仍然具有挑战性，无法获得有关m⁶A修饰的基础和空间信息。在细胞和空间异质性方面，单细胞水平上可视化和量化m⁶A RNA的能力对于理解翻译后调节和解决m⁶A甲基化相关疾病至关重要。

近日，清华大学李景虹教授在《Angew. Chem. Int. Ed.》发表了题为“Single-cell Imaging of m⁶A modified RNA Using m⁶A-specific In Situ Hybridization mediated Proximity Ligation Assay (m⁶AISH-PLA)”的研究论文。该研究提出了一种m⁶A特异性原位杂交介导的邻近连接分析（m⁶AISH PLA），用于m⁶A RNA的细胞成像，允许识别RNA中特定位置的m⁶A修饰，并能够在单细胞和单分子分辨率水平下对m⁶A RNA进行成像。利用m⁶AISH PLA，研究了热休克应激下HSP70 RNA103-m⁶A的含量和亚细胞水平位置，发现热休克下m⁶A修饰率增加，在细胞质中的含量增加。m⁶AISH PLA可用于研究单个细胞中的m⁶ARNA，以破译外转录组学机制并辅助临床诊断。

图1 A） 基于MB的用于检测m⁶A RNA的m⁶AISH PLA示意图。B） 影响m⁶AISH PLA效率的邻近探针的配置。C） 实验中使用了邻近探针的结合位点。邻近探针的设计分别为N⁶腺苷的0nt、5nt、10nt、15nt、20nt、25nt。D）在（C）中不同邻近探针对基于MB的m⁶AISH PLA的荧光响应。E） mRNA序列的特异性以及与未修饰腺苷（A）去分m⁶A。PLA探针和phi29聚合酶的浓度分别为10 nM和0.25 U/μL。因此，这是一种高度敏感的分析方法，可用于定量RNA中特定位置的m⁶A修饰。

图2 m⁶AISH PLA用于单细胞中m⁶A RNA的原位成像。(A) HSP70 RNA103-m⁶A在Hepa1-6细胞中通过m⁶AISH PLA显示的荧光图像示例。亮绿色点表示HSP70 RNA103-m⁶A的扩增子，细胞核显示为灰色（DAPI），细胞轮廓用灰色虚线标记。标尺：10μm。每个单元放大器的频率直方图显示在底部（单元编号≥100)。 (B)热储存前后单个细胞中HSP70 RNA103-m⁶A和HSP70 mRNA拷贝数的直方图(C)热储存前后HSP70 RNA103-m⁶A和HSP70 mRNA平均表达的量化。与现有方法相比，m⁶AISH-PLA不仅可以在单细胞水平上精确定量m⁶A修饰的RNA，而且可以提供修饰程度和细胞异质性水平的信息。

图3 在Hepa1-6细胞中定位HSP70 RNA103-m⁶A的空间模式。(A)提取特征以描述单个细胞中扩增子的定位。(B)热休克前后HSP70 RNA103-m⁶A到细胞质心的平均距离的量化。(C)定量分析细胞核或细胞质中HSP70 RNA103-m⁶A的百分比。(D)热休克时m⁶A RNA表达的示意图。结果表明m⁶A甲基化与mRNA的空间分布在功能上相关。

在本研究中，提出了一种m⁶A特异性原位杂交介导的邻近连接分析（m⁶AISH PLA），用于m⁶A RNA的细胞成像，允许识别RNA中特定位置的m⁶A修饰，并能够在单细胞和单分子分辨率水平下对m⁶A RNA进行成像。虽然m⁶AISH PLA的吞吐量相对较低，并且由于PLA在物理距离上的限制，无法在短序列范围内区分m⁶A位点，但它与现有技术相比具有明显的优势：（1）m⁶AISH PLA可以通过m⁶A修饰和RNA序列的两个识别事件在mRNA的特定位置识别m⁶A；（2）m⁶AISH PLA的等温和温和条件有助于保存细胞结构和形态，并有可能分析组织中m⁶A修饰的RNA；（3）一靶一扩增子扩增使我们能够以单分子分辨率定量m6A RNA，从而提供准确的空间和定量测量。m⁶AISH PLA可用于研究细胞间的变异和空间格局，并有望破译转录后功能和涉及不同细胞过程和疾病发生的翻译控制机制。在未来，可以使用荧光量子点实现m⁶AISH PLA的复用能力，并且使用超分辨率荧光成像提高空间分辨率将有助于识别RNA序列中位置较近的m⁶A。

李景虹，中国科学院院士，清华大学化学系教授，化学系学术委员会主任，清华大学分析中心主任，分析化学所所长，教育部长江特聘教授，国家杰出青年基金获得者，基金委创新团队负责人、英国皇家化学会会士。近年来致力于电分析化学、生物电化学、单细胞分析化学、纳米电化学及能源环境电化学等领域的教学科研工作。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202109118

编辑：冯灿

审核：杨思慧

推送：钟彩君