核酸定点切割工具的研究日益受到人们的关注。尤其是最近出现的与位点特异性断裂密切相关的可正交激活DNA器件。现有的切割策略大多是基于外源辅助，如激光照射。内源性策略是正交可调节DNA机器探索关键的细胞内生物过程和细胞信号网络的非常理想的策略。

成果简介

近日，清华大学的张新荣课题组在《J. Am. Chem. Soc.》上发表了题为“Site-Specific Scissors Based on Myeloperoxidase for Phosphorothioate DNA”的研究论文。文中，该团队发现了用髓过氧化物酶(MPO)对硫代磷酸(PT)修饰的DNA进行精确的位点特异性切割反应，揭示了MPO通过氯化物氧化破坏PT修饰的剪刀式机理。此外，该团队还成功地将该剪刀用于激活PT修饰的发夹DNA机器，以产生类似辣根过氧化物(HRP) 模拟 DNAzyme 或引发杂交链反应 (HCR) 扩增。由于MPO在与细胞氧化应激相关的通路中发挥着重要作用，因此通过该工具箱激活的HCR放大，使得活细胞中的氧化应激得到了稳健的成像。这项工作提出了一种精确的内源性位点特异性切割工具，用于生物刺激的研究和 DNA 分子装置的构建。

图文解读

图1 基于MPO的PT修饰dsDNA的分子剪刀。(A)−(E)剪刀在不同反应条件下与PT改性dsDNA-BF相互作用的示意图：(A)与MPO(10 μg/mL)、H₂O₂(100 μM)和Cl⁻(150 mM)相互作用；(B)不含H₂O₂；(C)不含MPO；(D)不含Cl⁻；(E)仅含PT改性dsDNA-BF。当剪刀破坏PT修饰时，dsDNA-BF的荧光团和猝灭剂会相互远离，荧光信号增强。

图2  MHC剪刀切割PT改性DNA的机理研究。(A) oligo-random-PT底物位点特异性切割的变性PAGE表征。最左边的泳道：Marker。通道1和通道2：裂解反应的理论产物。通道3：未经PT修饰的基质，带MHC剪刀。通道4−6：MHC剪刀切割底物，加入不同浓度的MPO(通道4：10 μg/mL；通道5：4 μg/mL；通道6：0 μg/mL)。(B)PT修饰的MHC剪刀切割dsDNA-BF的实时荧光光谱。F和F₀分别代表有无MPO的荧光强度(MPO：10 μg/mL，H₂O₂：100 μM，Cl⁻：150 mM)。(C)AZD5904体外抑制MHC剪刀的荧光光谱。(D)AZD5904抑制剂的剂量依赖性抑制曲线(抑制剂浓度：0，500 nM，1 μM，5 μM，10  μM，50 μM，500 μM)。(E)切割反应对不同浓度H₂O₂(0、10 NM、100 NM、1μM、10μM、100μM和1 mM)的荧光反应。(F)不同浓度Cl⁻(0、1 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、150 mM和200 mM)对切割反应的荧光响应。在(B)−(F)中，PT修饰的双链DNA-BF是反应底物。误差条是三个平行测量的标准偏差。

图3  (A) MHC激活的HRP模拟DNAzyme通过ptG4-发夹的位点特异性断裂的示意图。 (B)用不同条件处理的H₂O₂氧化的TMB的紫外-可见光谱和比色结果。红线：(a) MPO：5 μg/mL，H₂O₂：100 μM，Cl⁻：150 mM，ptG4-发夹DNA：500 nM。蓝线：(b)仅 ptG4-发夹DNA。橙色线：(c)没有ptG4-发夹。绿线：(d)既没有hDNA也没有MHC剪刀。 (C) 黑色空心点代表MHC剪刀激活hemin/G-quadruplex-DNAzyme机器与不同浓度ptG4-发夹(1 nM, 2 nM, 4 nM, 6 nM, 8 nM, 10 nM, 20 nM、40 nM、60 nM、80 nM、100 nM、200 nM、500 nM 和 800 nM）。紫色空心圆点代表没有MPO的阴性组。 (D)和 (E) MHC剪刀切割不同PT修饰的发夹DNA（改变 PT 修饰位置和数量）的效果比较。 (F) MHC剪刀用不同的G4-DNAzyme序列破坏发夹DNA。A_mixis是裂解反应后TMB氧化的OD值，A_B-G4代表没有MPO的对照组。误差棒是三个平行测量的标准偏差。

图 4  (A) MHC剪刀激活的HCR反应示意图。 (B)传统I₀启动HCR和MHC激活HCR的琼脂糖凝胶电泳表征。 “+ ”和“-”分别代表相应成分的存在和不存在。(C) ptHCR-发夹响应不同浓度MPO（0、25 ng/mL、50 ng/mL、250 ng/mL、625 ng/mL、1.25 μg/mL和2.5 μg/mL的荧光光谱）。 (D)荧光强度与MPO浓度（0、25 ng/mL、50 ng/mL、250 ng/mL、625 ng/mL、1.25 μg/mL 和 2.5 μg/mL）的校准曲线。 (E)由各种干扰激活的HCR扩增的标准化荧光结果。GSSG：5 mM；PMA：10 μg/mL；LPS：10 μg/mL；其他 ROS：100 μM。所有这些都与MHC剪刀组进行了比较。 *** P < 0.001由t 检验确定。误差棒为三个平行测量的标准偏差。

图5  (A) 在外部刺激下细胞内MHC-HCR扩增示意图。 (B)巨噬细胞RAW264.7由刺激引发HCR的CLSM成像：(a)阴性组：无外部刺激；(b)用H₂O₂ (100 μM)预处理；(c)经 MPO(10 μg/mL) 和 H₂O₂ (100 μM)（MHC系统）预处理；(d)用 ClO^-(10 μM) 预处理； (e) 经PMA (4 μg/mL)预处理； (f) LPS (8 μg/mL)预处理。绿色通道是HCR的放大响应(ex: 488 nm, em: 525 nm)，细胞核被Hoechst 33258染色（蓝色通道，ex：346 nm，em：460 nm）。(C) 和 (D) 为在不同条件下对细胞样品进行流式细胞术检测。通过流式细胞术计数的平均荧光强度 (MFI) 约为10000个活细胞。实验重复3次，误差棒表示标准差。Ns 无显着差异。***P < 0.001和****P < 0.0001由t 检验确定。

图6  LPS 刺激下，RAW264.7细胞中MHC-HCR扩增的CLSM实时成像。 (A) 将细胞与LPS(8 μg/mL) 从0 分钟到2小时30分钟的孵育。LPS刺激60分钟后将商业 ROS染料（ex：594 nm，em：618 nm）混合到细胞中。(B) DHE和HCR扩增在不同时间的平均荧光值。 (C) 有无LPS刺激的条件下，不同时间的MHC剪刀激活对HCR 扩增的结果比较。 *** P < 0.001由t 检验确定。

总结与展望

本文首次研究了髓过氧化物酶对硫代磷酸酯修饰的剪切反应，成功地使用剪刀系统来控制功能性DNA片段从发夹结构中的释放。对ptG4-HCR进行定点修饰后，产物自发转化为hemin/G-quadruplex-DNAzyme机器，可有效提高系统的氧化能力。同时，ptHCR-发夹的存在提供了触发HCR扩增以选择性地响应MPO的可能，总而言之，活细胞氧化应激途径的实时成像已经取得了成果。此外，PT是细菌中一种独特的表观遗传修饰，其对细菌和宿主的氧化应激研究很少，而这项工作为研究PT修饰在细菌和宿主中的拮抗作用提供了新思路。

团队简介

张新荣教授，清华大学化学系（分析中心）教授，博士生导师。该课题组的研究方向是分析化学。研究重点为光谱和质谱仪器、分析方法及其在生命科学中的应用。

课题组主页：www.xrzhanggroup.com

文献链接

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c06370

编辑：陈慧芳

审核：杨思慧

推送：钟彩君