核蛋白的ADP核糖基化是DNA损伤修复途径的重要特征。组蛋白是ADP核糖基化的主要靶点，在DNA损伤之后用单一的ADP核糖单位修饰丝氨酸。细胞对断裂的DNA的第一反应之一是多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶Ⅰ（PARP1）。这种酶在DNA断裂时激活，随后PARP1调节染色质的结构和招募参与DNA修复的蛋白质。ADP-核糖化的生物学和临床意义对调节细胞通路并描述其在DNA修复中的功能有着至关重要的意义。

成果简介

近期，普林斯顿大学化学系教授Tom W. Muir在《J. Am. Chem. Soc.》上发表了题为“Synthesis of ADP-Ribosylated Histones Reveals Site-Specific Impacts on Chromatin Structure and Function”的研究论文。本研究开发了一种高效、模块化的半合成路线，用化学的方法将全长的ADP-核糖基化的组蛋白锚定在丝氨酸残基上。用修饰过后的组蛋白所产生的各种ADP-核糖基化的染色质底物，用于生物物理检测。除此之外，在使用一组赖氨酸甲基转移酶的生化实验中，利用ADP-核糖基化的核小体揭示对组蛋白H3K9甲基化的环境依赖的抑制。这种设计有望促进关于组蛋白ADP-核糖基化在DNA损伤{attr}3115{/attr}研究。

图文解读

图1：响应DNA损伤，组蛋白变成单腺苷二磷酸核糖。组蛋白旁化因子1(HPF1)与PARP1结合是组蛋白H3和H2B上丝氨酸残基的ADP核糖基化所必需的，聚糖水解酶(PARG)的作用是将最初的多-ADP-核糖化产物快速转化成单-ADP-核糖化的组蛋白。这种修饰对染色质结构和功能的影响尚不清楚。

图2：ADP-核糖基化染色质的合成。 （a）改进的“树脂焦磷酸盐”形成腺苷二磷酸核糖化肽α-硫酯，将联氨连接物负载到三苯基树脂上，整个合成过程得到高纯度的腺苷二磷酸核糖化肽α-硫酯。（b）通过无痕天然化学连接的手段产生ADP-核糖基化的组蛋白。然后，通过自由基介导的半胱氨酸连接“SCAR”进行脱硫得到全长的腺苷二磷酸核糖化肽α-硫酯。（c，d）H2BS6ADPr和H3S10ADPr的ESI-MS表征，说明已经合成出H2BS6ADPr和H3S10ADPr。（e）天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明庞大的阴离子ADP-核糖部分没有妨碍有效的单核糖体（MN）形成。（f）在盐梯度透析和Mg²⁺诱导沉淀纯化了12聚体阵列后，使用天然凝胶电泳对琼脂糖-丙烯酰胺复合凝胶对ADP-核糖基化的12个单体的阵列分析以及在限制酶消化MN和用ARH3处理后的分析。该数据表明在用BstXI限制性酶消化阵列到MNs会产生预期的腺原糖化MNs。

图3：ADP核糖基化对高阶染色质结构的影响。（a）在存在或缺少1 mM的Mn²⁺的情况下的12-mer核心阵列的综合沉降系数分布，例如沉积速度实验和Van Holde-weischet全分界面拟合分析，H3ADPr阵列的类似于未经修饰的对照，但H2BADPr阵列在添加Mg²⁺后沉积速度明显减慢可能是双重改性的ADPr阵列的致密性差，在36S处沉积的结果。（b）Mg²⁺介导的各种阵列自缔合，确定离心后溶液中剩余的材料百分比。离心后残留在上清液中的物质减少，这反映在沉淀H3ADPr标记所需的更高的Mg²⁺浓度上。

图4：ADP核糖基化对组蛋白甲基转移酶活性的影响。（a）自显影图分析G9A介导的H3K9各种MN的甲基化。使用核心组蛋白的新型考马斯亮蓝染色作为MNS的加载控制。相比之下，H2BS6ADP-核糖基化本身并不影响G9a的活性。这表明，H3S10腺原糖基化对G9a活性的抑制作用发生在cis中，这可能是由于G9a无法接触其靶赖氨酸所致。 （b）a图中自动显影的定量。（c-e）蛋白质印迹分析ADP核糖基化对MLL1、PRC2和NSD2的甲基转移酶活性的影响。与G9a介导的H3K9甲基化相比，H3K4和H3K27的甲基化通过H3S10加成核糖甲基化而适度增加。这种效应可能与通过ADP-核糖基化调节H3末端动力学有关，因为H3末端修饰削弱了其与核小体DNA的结合。

总结与展望

综上所述，本文开发了一种高效合成腺苷二磷酸核糖基化多肽α-硫酯的方法，使得通过蛋白质半合成生产天然全长腺苷核糖化组蛋白成为可能。利用ADP-核糖化的H2B和H3制备化学定义的ADP-核糖化的单核糖体和核小体阵列，用于各种生物物理和生化实验。这些研究表明：(I)组蛋白单-ADP-核糖化足以阻止染色质压实和组蛋白PTM沉积，(Ⅱ)ADP-核糖化的特定位点是决定这些效应的关键。本文揭示了组蛋白单-ADP-核糖化在DNA修复中的作用，也强调了ADP-核糖化染色质底物在探索这一独特修饰的效果方面的价值。

作者简介

Tom W. Muir

普林斯顿大学化学系教授

研究方向：生物医学兴趣的复杂系统的蛋白质功能的物理化学基础。使用有机合成和物理化学工具结合分子遗传学研究蛋白质功能。在一系列生物学问题的推动下，开发了通用的化学生物学方法，使蛋白质的共价结构能够以类似于较小有机分子的控制水平进行操纵。 这些技术既可在体内也可在体外应用，允许插入非自然氨基酸、翻译后修饰和同位素探针——特别是在蛋白质的任何位置。

文献链接

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.1c05429

编辑：章振华

审核：田风玉

推送：袁燕燕