细胞转录组的复杂性给生物学家和化学家分析和理解许多单个RNA种类的动力学，折叠和功能带来了挑战。用于分析生物聚合物的最重要的化学策略之一是开发选择性和有效的化学功能化方法。这样的方法可以实现成像，定量，结构分析和固定化，这是生物学和医学中所有必不可少的工具。尽管蛋白质的选择性化学功能化反应的开发在几十年中取得了长足的进步，但与RNA形成化学键的方法的开发仍处于早期阶段。特别是在转录的RNA的内部位点形成键的方法仍然非常有限或非选择性。以DNA为模板的1,N6-腺苷腺苷衍生物的产生提供了一种位点特异性RNA标记的方法，但需要密集的合成，延长的时间和较长的过程。重氮酮可用于与链中的无规磷酸盐反应；但是，在内部位点会产生水解不稳定的RNA磷酸三酯键。诸如补骨脂素之类的光交联剂仅对折叠的RNA中的双链区域具有选择性，并且不用于特定功能化，而是用于结构映射的产率较低。在胞嘧啶和腺嘌呤上发生反应的碱基反应剂（如二甲基硫酸盐），在鸟嘌呤上发生反应的茚三酮对未配对碱基的选择性仅高于配对碱基，并阻止碱基配对。最后，许多在未配对核苷酸的2-OH基团上形成键的酰化试剂已被广泛用于痕量产率的结构作图。然而，由于它们的低溶解度和非常高的反应性，它们通常不适合高产率官能化。重要的是，对于这些基本随机反应中的任何一种，都没有报道用于序列选择或位点选择反应的方法。

美国斯坦福大学的Eric T. Kool教授于本月在J.Am.Chem.Soc.上发表了一篇题为“Site-selective RNA Functionalization via DNA-induced Structure”的研究论文。文章通过开发一种用于RNA的定点酰化的通用策略来解决2-OH修饰选择性的问题。 利用双链结构中RNA的低反应性，利用互补的DNA寡核苷酸保护RNA中除所需反应位点以外的所有反应位，继而诱导环上的RNA酰化（RAIL）的方法。文章显示，可以通过适当设计和廉价的辅助DNA诱导RNA中的反应性缺口或环，从而在预定位点产生高产率的酰化。该方法具有序列选择性，并且反应以近核苷酸分辨率发生，并允许随后的RNA标记和控制。 作者认为RAIL方法广泛适用于许多RNA种类，并且可以为许多化学和生物学实验室所用。

图1 用于位点选择性RNA酰化的RAIL方法的示意图。 将目标RNA（R）与一个或多个互补辅助DNA（H）孵育以保护大部分RNA，但在环（a）或缺口（b）中留下单个未配对的核苷酸。 然后，暴露的2-OH基团可以与酰化试剂，例如NAI-N3，选择性地反应，在去除辅助DNA后产生位点定义的功能化RNA。 注意，大于单个核苷酸的环和缺口也是可能的。

图2 优化辅助DNA免受随机RNA酰化的保护。 （a）具有完整DNA补体的单链RNA（ssRNA）和RNA-DNA双链的酰化示意图。 （b）酰化的ssRNA（R）的MALDI-TOF质谱图，完全互补DNA（R / H）保护的RNA，两端均带有三个脱氧腺苷（R / Ho）和2-deoxy- 3-磷酸修饰的RNA，具有3a突出端的完全互补DNA保护（Rp / Ho）； 在MOPS缓冲液中与50 mM NAI-N3在37℃反应4h。 （c）逆转录酶（RT）引物延伸的凝胶电泳分析显示，由于受保护的RNA，除在中央C，U位点发生微量反应外，一般都没有终止位。

图3 在DNA诱导的环上RNA酰化的表征。 （a）示意图显示诱导的环RNA酰化的过程。 （b）DNA保护的RNA（Rp / Ho），DNA诱导的1nt凸起RNA（Rp / Ho-L1）和DNAPage诱导的3nt环RNA（Rp / Ho-L3）的MALDI-TOF质谱与200 毫米NAIN3。 （c）与200 mM NAI-N3反应的无环（R / Ho），1nt凸起（R / Ho-L1）和3nt环（R / Ho-L3）的RNA样品的RT终止子的凝胶电泳分析。 凝胶中条带的序列和位点如图所示。 注意，RT终止（和相应的条带）出现在紧接酰化残基3的核苷酸处。

图4 诱导缺口处RNA酰化的表征。 （a）诱导间隙RNA酰化步骤的示意图。 （b）对无间隙（R / Ho），缺口（R / Ho-N），1nt间隙（R / Ho-G1）和3nt间隙（R / Ho-G3）的RNA样品进行RT终止的凝胶电泳分析， 与200 mM NAI-N3反应。 序列和位点如所示。

图5 通过移动39 mer RNA靶中环或缺口的位置来编程局部酰化位点。 如图所示，对于在不同位置具有1nt凸起或缺口的样品，RT终止的PAGE分析。 凝胶中移位带的比对序列如图所示。 注意，RT终止（和相应的条带）出现在紧接反应位置3的核苷酸处。

图6 用于串联核酶的现场选择性可编程控制的RAIL方法。 （a）具有两个催化核心（3TR，5TR）和两个双重标记的3S底物（3TR），5S（5TR）的串联核酶的序列； 下面通过RAIL方法显示TR的选择性酰化，得到3TR酰化的核酶和5TR酰化的核酶。 （b）RAIL方法的机制可实现对串联核酶的位点选择性控制。 （c）显示相对于未反应的TR（标准化为1.0）的每种底物（3S和5S）裂解的相对初始速率的图。

图7 连续RAIL方法对65nt小核仁RNA（SNORD78）进行双重标记，并通过FRET观察折叠。 （a）SNORD78 RNA序列，带有蓝色标记的标记位点（带有Alex488的G14；带有TAMRA的A49）。 通过两个连续反应进行RNA双重标记的过程示意图。 （b）双标签RNA凝胶分析的图像； Alex488（绿色）和TAMRA（红色）通道的叠加显示两种染料的重合。 （c）FRET信号响应缓冲液相对于水的RNA结构变化（供体在490 nm激发时发出荧光）。

在特定位点对RNA功能化的方法有很高的要求，但仍然是一个挑战，特别是对于通过转录而不是通过全合成产生的RNA。最近的研究已经描述了酰基咪唑试剂，该试剂在非碱基配对的区域中以2-OH基团的高产率随机反应，覆盖了分散的酰基酯中的许多RNA。如果可能的话，局部反应可能会在许多应用中证明是有用的，可以在生物聚合物的特定位点和序列上提供功能性处理。在这篇文章里，作者描述了在定点的2-OH基团上进行RNA体外功能化的DNA定向策略。该方法称为“诱导环RNA酰化”（RAIL），它利用互补的辅助DNA寡核苷酸来暴露选定位置的缺口或环，同时保护DNA-RNA双链体中的其余部分。然后进行与酰基咪唑试剂的反应，从而在预定位点提供高产率的2-OH共轭。实验揭示了最佳的辅助寡聚脱氧核苷酸设计和反应条件，并对该方法进行了测试，以控制局部核酶活性并用双色荧光染料标记RNA。 RAIL方法为可能进行任何长度和来源的RNA的位点选择性标记和控制提供了一种简单新颖的策略。

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c06824

埃里克·库尔（Eric T. Kool）生于伊利诺伊州的利伯蒂维尔（Libertyville），并在俄亥俄州牛津的迈阿密大学完成了本科学习。他以哥伦比亚大学NSF研究员的身份继续从事有机化学研究生的研究，并获得了博士学位。 1988年，以NIH博士后研究员的身份继续在Caltech接受培训。 1990年，他加入了罗切斯特大学（University of Rochester）的教职，并于1997年晋升为教授。1999年，他将实验室迁至斯坦福大学，在那里他是乔治·希尔达·道伯特（George and Hilda Daubert）化学教授。在斯坦福大学，他是Bio-X计划（生物物理学计划）的成员，并且是ChEM-H的会员。 Kool的研究兴趣在于有机化学，化学生物学和生物物理学的跨学科领域。他的工作旨在设计新的功能上有用的分子工具，并将其应用于对涉及核酸的生物相互作用和机理的基本了解。他最重要的贡献之一是开发了称为非极性核苷等位基因的DNA碱基模拟物，这使他的实验室发现DNA复制可以在没有Watson-Crick氢键的情况下发生。滚环扩增（RCA）和滚环转录（RCT）的发明，它们是等温DNA / RNA扩增方法。设计的DNA碱基在活细胞中的首次成功应用；从修饰的DNA开发许多荧光酶探针；以及用于成像和绘制细胞RNA结构的分子探针的开发。迄今为止，已有超过275种出版物描述了Kool的工作，他在美国和国外举办了250多次受邀的演讲。他的实验室分子工具已经发现了许多有用的应用，并且他是30项已授予或正在申请的专利的发明者。他的发明被用作三个不同生物技术公司的创始技术。库尔因其研究而获得了许多国家奖项，包括德雷福斯基金会教师-学者奖学金，阿尔弗雷德·P·斯隆基金会奖学金，美国化学学会的亚瑟·C·科普学者奖，ACS辉瑞奖和ACS Breslow奖。他还被任命为美国科学促进协会会员。 Kool在其实验室中培训了120多名研究生和博士后研究人员；其中有三十多个已在全球担任学术职务。他是斯坦福大学二年级有机化学的热门老师，曾两次获得人文与科学学院院长杰出教学奖。

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