J. Am. Chem. Soc.: 使用单分子阵列实现酶活性的超灵敏检测

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引言


酶活性的检测对于临床诊断、功能蛋白质组学和药物发现等许多应用都具有重要意义。迄今为止,科研工作者们已经开发了用于检测酶活性及筛选抑制剂的不同方法,包括质谱、电化学、毛细管电泳、放射性标记、比色分析和荧光方法。但当前用于酶活性测量的方法通常具有较低的分析灵敏度。近年来,高效的小分子抑制剂已成为治疗许多疾病(例如癌症)的有效药物,而精确分析具有亚纳摩尔或皮摩尔范围内抑制常数(Ki)的紧密结合抑制剂需要接近或低于Ki值的低浓度酶。但较低浓度的酶产生的信号极弱,因此迫切需要一种可以进行超灵酶分析的检测技术。



成果简介

近日,来自哈佛大学医学院的病理学教授David R. Walt在国际著名期刊《J. Am. Chem. Soc.》上发表了题为“Ultrasensitive Detection of Enzymatic Activity Using Single Molecule Arrays”的研究论文。本文中,作者开发了一种使用单分子阵列(eSimoa)检测酶活性的超灵敏方法。利用生物功能化的磁珠捕获目标分析物并保证每个磁珠结合的目标分析物为01。通过生物素化的检测探针与磁珠上捕获的目标分析物结合,并进一步用报告酶-链霉亲和素-β-半乳糖苷酶(SβG)进行标记和分析,从而实现蛋白酶的超灵敏检测。作者证明了eSimoa分析方法具有前所未有的灵敏度,可用于检测蛋白激酶、端粒酶和多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶的活性。



图文解读

图1 基于eSimoa分析方法使用多肽修饰的磁珠(MBs)作为基底检测蛋白激酶活性的示意图。在eSimoa分析中,将结合有底物多肽的MBs与目标酶和辅因子共同孵育,随后反应得到的产物被生物素化的检测探针所识别,并进一步被SβG标记用于Simoa分析。


图2 检测(A)原癌基因酪氨酸蛋白激酶(Src)和(B)Abelson小鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Ab1)活性的响应曲线。采用eSimoa分析方法对Src和Ab1的检测限分别为4.9 fM和4.2 fM,相比传统的方法具有较高的灵敏度。


图3 eSimoa用于端粒酶活性检测的示意图。将底物寡核苷酸预缀合至MB的表面,在存在dNTP混合物的情况下,以端粒酶的固有RNA作为模板,结合的端粒酶催化端粒重复序列(TTAGGG)n加到底物的3'端。温育和磁分离后,将结合的端粒酶洗掉,并加入由互补序列组成的生物素标记的检测探针。最后,添加SβG标记MB用于Simoa分析。


图4 使用Simoa分析方法检测端粒酶活性的响应曲线。


图5 使用抑制剂bosutinib抑制Src(A)及Ab1(B)和使用抑制剂dasatinib抑制Src(C)及Ab1(D)的不同预孵育时间下的剂量反应曲线。这些结果表明,eSimoa分析方法可用于评估抑制剂的效力,尤其是用于筛选紧密结合的抑制剂。


图6 (A)K562和(B)HEK293细胞裂解液中Ab1活性检测的条形图。结果表明,信号随着细胞数量的增加而增加,检测到的最低激酶浓度对应于从1个细胞中提取的K562浓度和从30个细胞中提取的HEK293浓度。


图7 检测单个细胞中Bcr-Ab1的活性(A)和平均信号变化(B)。当仅将缓冲液添加到单细胞裂解液中时,信号具有相对较宽的分布,证明了细胞之间的异质Ab1活性。在存在抑制剂dasatinib和bosutinib的情况下,信号分布移至较低的AEB信号,并且平均信号由于抑制而降低。这些结果表明,eSimoa分析方法可用于测量单细胞中的激酶活性。



总结与展望

总而言之,本文作者通过将底物缀合到顺磁性磁珠上并使用底物到产物的转化实现了eSimoa分析,同时采用eSimoa检测方法成功检测了SrcAb1,端粒酶,SET7 / 9GalNAcT的活性。尽管这些酶通过完全不同的机制和在不同类型的底物上起作用,但是eSimoa分析都可以实现酶的超灵敏检测,这表明eSimoa方法是一种既灵敏又灵活的通用方法。并且eSimoa分析方法已成功用于确定抑制剂bosutinibdasatinib的抑制常数。由于这种方法的超灵敏性,作者在单细胞水平上实现了激酶活性的检测并为酶相关的基础研究和抑制剂筛选提供了有希望的平台。



作者简介

David R.Walt是哈佛医学院病理学系的教授,同时也是霍华德·休斯医学院的教授,拥有密歇根大学的化学学士学位和博士学位,SUNY的化学生物学博士学位,并在MIT进行了博士后研究。他率先将微孔阵列用于单分子检测和分析,彻底改变了基因和蛋白质组测序的流程,使DNA测序和基因分型的成本在过去十年中下降了近百万倍,并且这项技术现在已成为在各种应用中进行测序的金标准。他是Illumina公司和Quanterix Corp的科学创始人,并与其他几家生命科学初创公司共同创立了公司。此前,他是塔夫茨大学的神经科学与口腔医学教授。目前他是美国国家工程研究院,美国国家医学研究院的成员,美国艺术与科学研究院的院士,美国医学与生物工程学院的院士以及美国发明家研究院的院士。他获得了许多奖项和荣誉,包括2017年美国化学学会的凯瑟琳·C·哈赫(Kathryn C. Hach)企业家成功奖,2016年的拉尔夫·亚当斯生物分析化学奖,2014年美国化学学会古斯塔夫斯·约翰·埃瑟伦奖,2013年分析化学光谱化学分析奖,2013年匹兹堡分析化学奖和2010 ACS国家发明创造奖。



原文链接

https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.0c06599



编辑:迷信

审核:CK




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