目前的研究发现在癌细胞内大量检测到G-四联体（G4s），这可能与癌症相关基因关系密切，并且推测G4s或许可以用作早期癌症诊断和治疗中新的分子靶标。之前有关G4s的研究报道中所使用的观察技术往往需要杀死细胞或使用高浓度的化学探针，从而观察G4s的形成。但由于细胞中G4s的稳态性可能受到蛋白质（例如解旋酶的调节），无法通过快速离体技术来追踪G4s。此外，一些常用于检测活细胞中DNA和RNA的探针浓度相对较高，这可能会干扰G4s的动态折叠过程以及引起细胞应激/毒性。

近日，英国剑桥大学化学与癌症研究系的Shankar Balasubramanian教授课题组在Nature Chemistry上发表了一篇题为《Single-molecule visualization of DNA G-quadruplex formation in live cells》的研究论文。该研究报道了一种G4特异性荧光探针（SiR-PyPDS）能在低浓度的条件下，结合少量G4s就可以实时追踪到活细胞核中的G4s的单个结构分子，实现了在不干扰G4s动态折叠的情况下，在活细胞中对其动态过程进行检测。此外，还证明了活细胞中G4s的形成是细胞周期依赖性的，并受到化学抑制转录和复制的破坏。

图1  G4s的体外单分子荧光成像。（a）G4结构（左）和G4二级结构（右）的示意图。（b）(1) G4特异性荧光探针（SiR-PyPDS）的化学结构以及它的非活性异构体SiR-iPyPDS(2)。SiR-PyPDS(1)是通过使用不同长度的连接体将远红色荧光团硅罗丹明（SiR）与G4配体吡啶酮（PyPDS）的类似物结合制备得到的。荧光滴定证实SiR-iPyPDS(2)的G4结合亲和力比SiR-PyPDS(1)低10倍以上。（c）用于可视化单个G4的方法的示意图。预折叠的G4-MYC通过生物素-中性亲和素链接体连接到盖玻片上。G4荧光探针SiR-PyPDS(1)与G4-MYC结合，可通过单分子荧光成像进行观察。（d）SiR-PyPDS不结合G4形成单链突变体MYC。（e）非活性异构体SiR-iPyPDS(2)结合亲和力较弱，与G4 MYC结合的可能性较小。（f）定量检测SiR-PyPDS (1)与G4 MYC的结合，SiR-PyPDS (1)与突变体MYC (Mut)的结合，SiR-iPyPDS (2)与G4 MYC的结合，以及在10μM未标记的PhenDC3存在的条件下，SiR-PyPDS (1)与G4 MYC的结合。（g）单个SiR-PyPDS(1)分子(250 pM)结合表面的预折叠MYC G4寡核苷酸的成像，单个荧光点状物表明有单一的SiR-PyPDS(1)分子结合。（h）SiR-PyPDS(1) (250 pM)与突变体MYC结合的成像。（i）SiR-iPyPDS (2) (250 pM)与预折叠MYC结合的成像。（j）G4配体与G4s的相互作用可以改变G4s展开和折叠之间的平衡。

图2用荧光探针SiR-PyPDS(1)对活细胞G4s进行单分子荧光成像。（a）细胞核内G4s的示意图，放大后显示经SiR-PyPDS染色的G4s(1)。（b）在成像前30分钟，使用20 nM的SiR-PyPDS(1)处理的活U2OS细胞，荧光斑点表明单链与SiR-PyPDS(1)分子结合。蓝色对应于Hoechst 33342核染色。（c）使用20 nM的SiR-PyPDS(1)对U2OS活细胞处理30分钟后，进行SiR-iPyPDS(2)染色的代表性图像。（d）对于SiR-PyPDS(1)和SiR-iPyPDS(2)，对每个细胞持续超过两帧（每帧100 ms）的细胞核内结合现象的定量分析。

图3   活细胞中的G4s的动态折叠和展开过程（a）SiR-PyPDS(1)在体外(上)和细胞内(下)的单分子延时成像。左边显示的是时间推移叠加的单个图像，右边则显示了SiR-PyPDS(1)与G4s的动态结合动力学。（b）每个实验的驻留时间直方图，用单指数拟合以确定每种条件下的结合寿命。（c）DMS对未折叠的G4s的化学捕获的示意图。（d）定量检测未经处理和经600 μM MDMS处理的G4 NYC 20 min的G4结合事件。（e）DMS (20 mM)增加后，活细胞中检测到G4结合事件的定量检测，显示出G4s明显的时间依赖性消耗。以上结果证明，SiR-PyPDS结合G4s观察到的时间相当，说明SiR-PyPDS可以用于检测内源性的G4s。

图4   G4s在活细胞中的观察受到细胞周期和转录的影响。（a）-（d），显示了S期(a)、G1/S期(b)和G0/G1期(c)同步的U2OS细胞和同时使用转录抑制剂DRB和复制抑制剂阿非迪霉素(d)处理的未同步的细胞中G4结合事件的代表性单分子图像。（e）在活的U2OS细胞中，在不同的细胞周期阶段和转录/复制停止后，对每个细胞持续超过2帧（每帧100毫秒）的结合事件的定量。通过对活细胞中G4s的单分子可视化技术,可以追踪G4s在特定基因中的作用以及它们在癌症中的表达方式。

该研究发明了一种荧光标记，它可以附着在人类活细胞的DNA G-四联体(G4s)上，首次可以观察到这种特殊的DNA结构的形成过程，以及它在细胞中行使的功能。这一成像平台的进一步应用将有助于实时揭示人类基因组中由个体G4调控的特定生物学功能。

https://www.nature.com/articles/s41557-020-0506-4

Shankar Balasubramanian，印度出生的英国化学家，剑桥大学化学系药物化学教授，英国剑桥癌症研究所高级组长，剑桥三一学院研究员，Solexa和Cambridge Epigenetix的科学创始人。

编辑：今晚月色真美

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