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组蛋白甲基化是强大的表观遗传标记之一，对于维持转录状态和决定细胞命运起着至关重要的作用。长期以来，组蛋白甲基化被认为是一种稳定、不可逆的修饰，直到2004年，施扬等人发现了第一种组蛋白去甲基酶（HDMs）——赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1），揭开了组蛋白甲基化的可逆调节机制，这些去甲基化酶通过调节染色质结构和转录进而影响广泛的生物学过程。多个研究表明，HDMs的异常表达与多种疾病有关，例如癌症、代谢综合征和神经系统疾病等。因此，检测HDMs的活性及其抑制剂的筛选对于表观遗传学研究和药物的开发至关重要。传统的HDM活性检测方法通常需依赖抗体识别或质谱分析。这些方法具有广泛的通用性，但由于其需要复杂的多步骤处理或使用昂贵的设备，在一定程度上限制了其应用范围。考虑到HDMs催化去甲基化过程中会生成小分子副产物甲醛（HCHO），因此可以通过定量检测HCHO来评估这些酶的活性。到目前为止，仅开发了几种基于HCHO的方法来检测HDM的活性，包括表面增强拉曼散射法和酶联分析法，这些方法也通常需要借助复杂的纳米材料合成或其他酶。因此，开发便捷、灵敏的HDMs活性分析方法仍是一个挑战。 近期，我们课题组开发了一种荧光和比色双信号传感方法用于组氨酸去甲基酶活性测定。该成果近期发表在《Analytical Chemistry》上，文章第一作者为硕士研究生邓璐。我们发现HCHO可以有效抑制Ag+触发的OPD氧化过程，导致荧光和比色信号同时降低。由于在HDMs催化的去甲基过程中会产生HCHO，因此可通过对生成的HCHO定量进而评估HDMs活性水平。通过该方法我们实现了体外赖氨酸特异性去甲基酶1（LSD1）活性的荧光、比色双信号测定，并成功用于细胞裂解液中LSD1活性评估，为表观遗传和医学研究提供了一个简单而强大的分析工具。 图1：（A）HDMs活性测定示意图：HDMs催化组蛋白去甲基化并释放HCHO，阻止Ag+氧化OPD过程。Ag+-OPD体系对HCHO和LSD1活性的（B）荧光和（C）紫外吸收响应情况：(1) OPD；(2) Ag+ + OPD；(3) Ag+ + HCHO + OPD；(4) Ag+ + H3K4(Me)2 +LSD1 + OPD。插图分别显示了在365 nm紫外光照射和可见光下的溶液照片。 图2：机理验证：（A）MALDI-TOF MS分析LSD1催化去甲基过程；（B）在Ag+-OPD体系反应前和反应后加入HCHO溶液荧光情况；随着（C）Ag+或（D）OPD浓度变化导致的Ag+-OPD体系和Ag+-HCHO-OPD体系的荧光变化情况。（E）Ag+-OPD体系和（F）Ag+-HCHO-OPD体系的透射电镜图。 图3：在反应体系中加入不同浓度LSD1的（A）荧光光谱图和（B）紫外吸收光谱图；加入不同LSD1浓度的反应后溶液（C）置于365 nm荧光激发下和（D）置于可见光下的照片；（E）荧光抑制效率和（F）吸收抑制效率与加入LSD1浓度的线性分析。 图4：（A）将该方法用于检测LSD1的特异性分析；（B）不同底物肽对于体系荧光抑制效率的影响；（C）在酶反应体系中加入不同浓度GSK-LSD1的荧光光谱图；（D）GSK-LSD1荧光抑制效率与其浓度关系图。 图5：（A）将该方法用于细胞裂解液中LSD1活性分析的示意图；HepG2和LO2细胞裂解液中加入H3K4(Me)2后的（B）荧光抑制效率和（C）吸收抑制效率分析；插图显示了两种细胞中LSD1表达量的Western Blot结果。 在本文中，我们通过将LSD1催化的去甲基化反应与HCHO抑制Ag+-OPD反应的巧妙结合，成功实现了LSD1活性的荧光、比色双信号测定。相对于传统的LSD1分析方法，我们的方法简单方便、同时具备多模式信号输出以及具有高灵敏度。该方法已成功在体外以及细胞裂解液中评估LSD1活性并可以分析其抑制剂的抑制作用，具有广阔的应用范围。此外，由于HCHO是蛋白质和核酸去甲基过程中形成的常见副产物，因此所提出的方法还可进一步拓展到检测不同的去甲基酶活性以及鉴定新型的去甲基酶中，并在实现酶阵列筛选方面具有很好的应用潜力。 https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.0c01927 DOI: 10.1021/acs.analchem.0c01927 编辑：一条咸鱼 推送：小䜣
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