on style="white-space: normal; line-height: 1.75em; box-sizing: border-box;">论文DOI：10.1002/anie.202107036 南京大学宋玉君教授及南京中医药大学韩欣教授团队合作构建了一种以乏氧响应性金纳米棒为基础的CRISPR-Cas9纳米复合物，利用乏氧敏感的偶氮键实现CRISPR-Cas9的按需释放，通过肿瘤靶向基因编辑以实现低温热疗。光热疗法（PTT）作为一种新兴的肿瘤治疗方法，由于其副作用小，疗效显著和时空操控精度高等特点，在肿瘤治疗领域引起了越来越多的关注。然而，这种疗法通常需要50℃以上的高温来消融肿瘤，这不可避免地会对附近的正常组织造成热损伤，并导致复发或转移的风险。因此，迫切需要采用温和的PTT策略来克服肿瘤的耐热性。而较低温度的PTT(38-43℃)则会激活癌细胞自我保护路径，如产生热休克蛋白(HSPs)，影响PTT的治疗效果。 因此如何在相对较低的温度下实现理想的治疗效果仍然是PTT临床转化道路上的一大挑战。
基于以上挑战，宋玉君教授和韩欣教授团队构建了一种以乏氧响应性金纳米棒为基础的CRISPR-Cas9纳米复合物APACPs，通过肿瘤靶向基因编辑以实现低温热疗。具体来说，该体系通过乏氧响应性偶氮苯-4，4'-二羧酸将Cas9/sgRNA与金纳米棒共价连接起来，并包被上聚乙烯亚胺。在乏氧肿瘤微环境中，APACPs中的偶氮基团被还原酶的过度表达选择性破坏，实现了Cas9的按需释放和随后的靶向HSP90α的基因编辑。由于HSP90α的基因敲除降低了肿瘤细胞的热阻，所以APACPs系统可以通过低温热疗实现高效的体内外肿瘤消融。这种治疗方案一方面实现了APACPs系统中Cas9/sgRNA在肿瘤微环境中的按需释放，另一面有效地克服了高温热疗引起的附近正常器官的热损伤，并以低损伤的方式杀死肿瘤细胞, 为低温热疗提供了提供了一个高效可行的方案。本文首先对APACPs进行了表征，证实了Cas9/sgRNA通过偶氮苯-4，4'-二羧酸的成功修饰。金纳米棒用巯基聚乙二醇胺基处理（表示为APs），之后与乏氧敏感的偶氮苯-4，4'-二羧酸共价链接（称为APAs）。随后，Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合物共价组装在APAs上（简称APACs）。为了促进细胞摄取，将所得纳米颗粒用带正电的聚乙烯亚胺包裹， 形成APACPs（图1A、B）。制备APACPs的逐步修饰过程也通过zeta电位分析，傅里叶变换红外光谱和紫外-可见吸收光谱进行了验证（图1C，E 和F）。为了直接证实Cas9/sgRNA的成功修饰，通过高倍透射电镜进行监测，在APACPs中发现了明显的金和磷元素，分别对应于金纳米棒和sgRNA（图1D）。▲图2. 近红外光照与基因编辑协同作用引发的A549细胞凋亡
接下来，本文系统验证了细胞水平上APACPs的乏氧响应特性及其在低温光热治疗上的效果。此处选择HSP90α基因作为靶位点进行基因敲除以实现低温热疗（图2A）。APACPs系统在与近红外光照(808nm）联合乏氧处理A549细胞时，其凋亡率显著增加至52.0%，远高于其他方法处理的细胞（2D, E）。Westernblot及SURVEYOR结果显示，与其他治疗方法相比，该方法良好的治疗效果由靶向敲除HSP90α基因，从而显著降低HSP90α表达实现（2B, C）。上述结果表明，APACPs可在乏氧条件下实现Cas9/sgRNA的按需释放，并在敲除HSP90α基因后，实现在较低温度下针对肿瘤细胞的有效治疗。随后本文进一步探究了动物水平上该系统针对肿瘤部位的治疗效果（3A）。在A549荷瘤小鼠模型中，与其他治疗方法相比，APACPs+NIR可以显著抑制肿瘤的生长（3B，C and D）。此外，苏木精-伊红染色、原位TUNEL分析和KI67染色显示，实验组的肿瘤部位损伤最为严重，而对照组的损伤程度较低。此外，HSP90α的免疫组化研究表明在实验组中发现HSP90α表达降低，突变分析也有力地证实了APACPs可通过Cas9介导的HSP90α基因敲除实现癌细胞对低温热疗的可耐受性降低（3E, F）。体内实验证实了在动物水平上，APACPs体系可在低功率红外光的辅助下，有效抑制肿瘤增长。本文构建了Cas9介导的低温热疗乏氧响应性纳米系统。在这个体系中，乏氧响应的偶氮苯被用来共价连接CRISPR系统和金纳米棒。通过制备靶向HSP90α基因的sgRNA，并将金纳米棒应用于光热转换器，将近红外光（808nm）转化为细胞内热，在体外和体内实现了靶向低温热疗和协同抗癌作用。这种基于基因编辑的纳米系统有效地克服了热疗引发的对周围正常器官的热损伤，并以微创的方式杀死了癌症，具有巨大的临床应用潜力。更重要的是，这项工作为肿瘤靶向基因编辑提供了一种有前景的策略，并将CRISPR-Cas9技术与精确医学联系起来。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202107036
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