转录组测序（transcriptome sequencing）是对某一物种的mRNA进行高通量测序，而转录组测序的结果反映了特定条件和特定时间点的基因表达情况。随着时间或外部的环境变化，转录组也会随之变化，除了转录衰减和mRNA降解现象，转录组包括了细胞内所有能转录出的mRNA，而转录组测序的结果反映了特定条件和特定时间点的基因表达情况^[1]。在参考基因组序列存在的情况下，转录组测序可以实现序列的变异鉴定^[2-4]、空间和时间表达谱测定^[5-6]、基因模型结构的验证和鉴定^[7-8]。在没有参考基因组的情况下，转录组测序也可以挖掘基因^[9-12]，进行对比分析^[13]，计算其表达丰度^[14-15]。

转录组研究的方法比较多，如基因表达序列分析（serrial analysis of gene expression）、表达序列标签（expressedsequence tag，EST）、基因芯片、高通量测序等^[16-17]。而现阶段转录组学研究主要依靠高通量测序技术。但是，对于非模式生物来说，大多数植物的基因组信息较为匮乏，而高通量测序的优势在于无需参考基因组，在没有获得物种的基因组信息的情况下仍可以进行转录组测序。另外，高通量测序获得的数据可以覆盖全部转录本，这对于挖掘功能基因是十分有利的。

1  转录组测序技术

1.1  第1代测序技术

沃森和克里克在1953年发现了双螺旋结构^[18]，了解核酸的空间结构后，人们开始研究对应的序列信息，测序技术也开始发展。1964年，Holley完成了对酵母丙氨酸转移tRNA的测序^[19]，自此核酸测序才正式出现。随后测序技术迅速发展。1977年，生物化学家Sanger发明了链终止测序法，一种基于T4 DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶的快速DNA测序方法^[20-21]。同年，Gilbert发明了化学降解测序法^[22]。这2种测序技术被认为是第1代测序技术。而后Sanger测序法渐渐占据了主要地位，现在普遍认为第1代测序技术为Sanger测序法。

1.2  第2代测序技术

人类基因组的测序工作结束后，人们想通过测序的方法来获得其他物种的基因信息^[23-24]。而传统的Sanger测序法比较费时费力、低通量且成本很高，不能满足日益增长的测序需求。很快人们开发出了第2代测序技术（next-generationsequencing，NGS）。第2代测序技术成本低、速度快，而且覆盖度较深，可以同时对数百万个DNA进行测序，核酸测序技术进入自动化时代^[25-27]，渐渐取代了Sanger测序法。高通量测序目前可在5个主要商业平台上获得：Roche（454）、ABI-SOLi D、Illumina基因组分析仪、Ab I3730xl基因组分析仪以及Heli Scope。现今应用较多的为前3者。

1.3  第3代测序技术

随着时间的推移，第2代测序技术的各种问题渐渐凸显，随后诞生了第3代测序技术，比较有代表性的测序技术：纳米孔单分子测序技术（Oxford Nanopopre Technologies公司）和单分子实时测序（single-molecular real-time，SMRT，PacBio公司）。第3代测序技术使用的是单分子测序技术，通量高和测序读数长。近年来应用较为广泛的是PacBio RSII测序平台，无需进行PCR扩增即可完成测序。平均读长可以达到10～15 kb，而最大读长可达64.5 kb^[28]。而第3代测序的准确率明显比前2代低，PacBio公司的SMRT测序技术准确率只能达到85%左右^[29]。这样一来，为了控制错误率无形中增加了测序的技术难度和成本^[30]。

2  转录组测序技术在药用植物中的应用

药用植物合成了无数的次级代谢产物，而这些次生代谢产物是研发新药的重要来源，如青蒿素（artemisinin）、人参皂苷（ginsenoside）、紫杉醇（taxol）等，但是它们的含量并不是很高。所以造成了药用植物的无序开发，资源日益减少。通过克隆关键酶基因及代谢工程生产药用植物药效成分已经成为药物生产和新药开发的主要研究方法^[33]。

相比已经完成基因组测序的模式生物，药用植物缺少基因组数据，遗传背景不清晰，发展缓慢。药用植物高通量转录组测序技术的出现，可以挖掘药用植物有效成分生物合成的功能基因并分析其表达规律，探索有效成分的生物合成途径及其调控机制，从而提高药用植物有效成分的含量。药用植物高通量测序为挖掘功能基因、探索药用植物有效成分的生物合成途径与调控机制、探索药材道地性分子机制、阐明基因功能提供了新工具。通过测序得到的信息，还可以挖掘参与植物生长发育、抗病抗逆等优良性状的基因。对于药用植物的保护具有极其重大的意义^[33-37]。

2.3 次生代谢产物生物合成途径挖掘

三萜皂苷是远志Polygala tenuifolia Willd.重要的药用成分之一。对不同年份的远志进行转录组测序^[66]，有176个Unigenes参与萜类化合物骨架生物合成，参与其他次级代谢产物的生物合成的Unigenes有522个。杠柳Periplocasepium Bunge中主要的生物活性物质C₂₁类固醇和杠柳毒苷均来自类固醇合成途径，对杠柳叶、根、不定根及愈伤组织进行转录组测序^[67]，筛选到24个参与类固醇生物合成途径的基因。贯叶金丝桃Hypericum perforatum L. 中的金丝桃素和褪黑激素是其主要的活性成分，具有抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗癌和抗菌作用，测序结果^[12]显示，2359个Unigenes与次生代谢产物通路有关，与金丝桃素和褪黑激素合成有关的Unigenes有260个。对虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. 根部进行转录组测序^[68]，获得86 418个Unigenes，总共有22 572个Unigenes注释到了119个KEGG通路。分别有12、18、60、54个Unigenes分别注释到甲羟戊酸（MVA）、甲基- D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）、莽草酸和白藜芦醇生物合成途径。

转录组测序技术应用于药用植物的研究情况见表2。

3 结语

本文综述了转录组测序技术在药用植物中的研究进展，转录组测序技术是一种转录组学的研究方法，遗传信息可以通过测序获得，在物种基因组信息未知的情况下，通过测序可得到遗传信息。由于药用植物遗传信息的匮乏，转录组测序技术逐渐应用于药用植物转录组的研究中。为了保护重要的药用植物及濒危药用植物的多样性及其可持续利用，在转录组水平上进行测序是非常必要的。

本文从功能基因挖掘、SSR分子标记开发和次生代谢产物生物合成途径探索3个方面阐述了转录组测序技术在药用植物中的应用。除了以上应用以外，转录组学的应用推进了药用植物中天然产物发现。植物可合成无数次级代谢产物，而这些次生代谢产物可以作为药物开发的新来源，研究药用植物有效成分的生物合成及其遗传机制有助于大规模生产这些有效成分。转录组测序技术还可以应用于某些有毒中药的减毒研究，它的出现有助于选育品质产量皆优的药用植物，阐明药用植物遗传信息及调控网络，探索中药防病治病的分子机制。转录组测序技术在药用植物研究领域必将拥有广阔的应用前景。

参考文献（略） 

来  源：慧  芳，刘秀岩，李宗谕，刘福顺，杨世海. 转录组测序技术在药用植物研究中的应用 [J]. 中草药, 2019, 50(24):6149-6155.