英文原题：Concerted Chemoenzymatic Synthesis of α-Keto Acid through Compartmentalizing and Channeling of Metal-Organic Frameworks   

通讯作者：Jiafu Shi (石家福)，Zhongyi Jiang (姜忠义)，天津大学

第一作者：Yizhou Wu (伍一洲)

生物制造是以生物技术为核心，利用酶或微生物细胞，结合化学工程技术进行目标产品的加工过程(绿色生物制造. 北京化工大学学报, 2018, 45, 107)。酶催化因反应条件温和、活性高、目标产物选择性高等特点，在绿色生物制造领域表现出广阔的应用前景。定向进化、合成生物学等新兴技术的出现进一步拓宽了酶催化的反应条件和反应类型。然而，酶的一些固有特性，如氧化还原酶依赖辅酶，氧化酶易产生有毒副产物等，限制了酶催化的应用范围。化学催化剂，例如贵金属、金属氧化物和有机金属配合物等，已广泛应用于多种化学反应。因此，研究者将酶催化与化学催化偶联，结合酶催化剂高活性、高特异性与化学催化剂易获取和多样性等优势，开发了酶-化学偶联催化系统，拓宽了反应路径、促进了副产物消除，提升了反应效率，实现了燃料、精细化学品和药物中间体的高效合成。

酶-化学偶联催化过程的全局效率主要受两个因素影响：即(1)酶催化剂和化学催化剂的固有活力与(2)酶催化过程与化学催化过程间的底物传递(反应物，中间产物或副产物)。构建酶-化学偶联催化系统的难点在于酶催化与化学催化反应条件不同，两种催化剂直接接触会引起催化剂中毒或失活，如酶催化剂的构象易受化学催化剂破坏。开发与酶催化剂兼容性强的化学催化剂可在一定程度保持酶活性。然而，该方法通常仅适用于少数酶催化剂。为此，研究者利用微囊膜或电解池空间分隔酶催化剂与化学催化剂，提升二者相容性。但并未考虑催化过程间物质传输。而这一点恰恰也是影响酶-化学偶联催化过程全局效率的关键。理论上讲，在酶催化剂与化学催化剂间构建底物通道可促进物质传递，提升全局效率。遗憾的是，同时协调酶催化剂与化学催化剂间相容性和物质传递以构建酶-化学偶联催化系统的策略鲜有报道。

生物体精巧的结构使其在进行复杂多催化过程时仍保持着高效的物质交换速率。在光合作用光反应中，水氧化和NADPH再生反应分别发生在类囊体膜的囊腔和基质侧。析氧反应中心Mn₄CaO₅在囊腔侧首先将水分解为氧气、质子和电子。质子和电子经过跨膜运输传递到基质侧参与由铁氧还蛋白-NADP还原酶(FNR)催化的NADPH再生反应。电子通过Z-Scheme电子传递链，经光系统II，细胞色素和光系统I传递到FNR；同时，“质子泵”ATP合成酶将质子从囊腔侧运输到基粒侧，为NADPH再生提供质子源。将水氧化和NADPH再生过程进行“隔室化”避免了高活性反应中心Mn₄CaO₅和FNR接触而引起的失活。电子和质子通道则保证了NADPH再生过程的能量和物质供给。相容性和能量/物质传递的协同强化确保了光反应过程的高效、持续进行。

受光合作用光反应作用机制启发，我们提出了“隔室化-通道化”策略来构建酶-化学偶联催化系统，以协调催化剂相容性和催化过程的物质传递(ACS Catal. 2020, 10, 9664)。金属有机框架(MOFs)因具有可设计的结构单元、丰富的配位位点、开放的框架结构和埃及孔道尺寸，已被广泛应用于固定化酶领域。此外，MOFs材料在构建复杂催化系统方面也很有潜力。酶催化剂和化学催化剂的“隔室化”可由框架结构实现，小分子底物的“通道化”则可通过调节孔道尺寸实现。本研究选择L-氨基酸氧化酶(LAAO)催化氨基酸氧化和Pt催化H₂O₂降解反应来构建酶-化学偶联催化系统。LAAO主要用于催化氨基酸氧化生成α-酮酸。然而，催化过程的副产物H₂O₂会引起α-酮酸脱羧过氧化，从而降低目标产物转化率。由于其生物毒性，H₂O₂的累积也可能导致酶失活。Pt纳米颗粒是促进H₂O₂分解的高效化学催化剂。将Pt纳米颗粒与LAAO偶联，可以消除H₂O₂以实现α-酮酸的持续合成。本研究选用UiO-66作为载体，构建了内负载Pt纳米颗粒-外吸附LAAO酶-化学偶联催化剂Pt@UiO@LAAO(PUL)。其中，UiO-66的固有孔(0.8 nm和1.4 nm)可实现两种催化剂分隔，同时确保底物H₂O₂在孔道内的自由扩散。通过对Pt纳米颗粒的位置和负载量进行调控，实现了催化剂间相容性和物质传递的协同强化，获得了99.7%的α-酮酸收率，较游离LAAO高出2倍以上(41.2%)。

图1. 酶-化学偶联催化合成α-酮酸示意图。

采用溶剂热法合成了Pt@UiO@LAAO酶-化学偶联催化剂，通过TEM mapping、HRTEM和CLSM(SI)等表征证明了内负载Pt纳米颗粒与外吸附L-氨基酸氧化酶。

图2. (a)Pt@UiO@LAAO (PUL) 制备过程示意图；(b-e)PUL催化剂元素分布；(f-g)PUL催化剂边缘和中心TEM照片。(h-i)PUL催化剂SEM照片。

PUL催化L-谷氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸：L-氨基酸氧化酶首先将L-谷氨酸转化为对应亚氨基酸，同时产生副产物H₂O₂，亚氨基酸经无酶水解反应生成吲哚-3-丙酮酸；Pt纳米颗粒催化H₂O₂分解，防止其氧化吲哚-3-丙酮酸脱羧生成吲哚-3-乙酸。

图3. (a)PUL催化合成α-酮酸过程示意； UiO@LAAO、PUL、UiO@Pt-LAAO和游离LAAO催化合成α-酮酸(b)随时间收率以及(c)初始反应速率与产率对比。

PUL催化L-谷氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸反应效率主要受两方面影响：(1)LAAO催化L-谷氨酸氧化速率；(2)Pt纳米颗粒催化H₂O₂分解速率。基于此，本研究测试了对应催化剂的H₂O₂分解速率，并通过圆二色谱图分析了酶催化剂与化学催化剂发生相互作用后的构象变化，以分析酶催化反应的本征速率。在PUL催化剂中，“通道化”可满足H₂O₂在UiO孔道内的自由扩散，“隔室化”则阻止了LAAO与Pt纳米颗粒的直接接触，以保持LAAO活力在较高水平。

图4. (a)Pt@UiO、UiO@Pt和Pt催化H₂O₂降解活性；(b)LAAO和Pt处理过LAAO圆二色谱图；游离LAAO和LAAO与UiO、Pt@UiO或UiO@Pt孵化4小时后的(c)圆二色谱图及(d)对应二级结构含量图。

通过调控Pt纳米颗粒的负载量和位置，实现了LAAO催化L-谷氨酸氧化速率和Pt纳米颗粒催化H₂O₂分解速率的匹配，吲哚-3-丙酮酸收率最高达99.7%(5小时)。并通过系列圆二色谱图，对LAAO失活机理进行了推测。Pt纳米颗粒具有强质子亲和性，易与LAAO外部肽链形成氢键，促使LAAO外部α-螺旋和β-转角打开；被打开的肽链重新通过侧链氢键连接形成β-折叠。在LAAO中，在FAD结合区和螺旋区域间的疏水通道连接着底物反应腔室与外部环境，用于将O₂从LAAO外部运输到活性位点。α-螺旋和β-转角结构的破坏可能会造成O₂运输通道的损坏，使FADH­₂无法被氧化为FAD，终止了氨基酸氧化反应。

图5.(a)高Pt和低Pt负载量PUL示意图；(b)PUL_(0.01)、PUL_(0.1)、PUL₍₁₎和PUL₍₅₎催化合成IPA随时间收率及(c)Pt@UiO_(0.01)、Pt@UiO_(0.01)、Pt@UiO₍₁₎和Pt@UiO₍₅₎催化H₂O₂降解活性；(d)PUL_(0.01)、PUL_(0.1)、PUL₍₁₎和PUL₍₅₎催化合成IPA初始反应速率；游离LAAO和LAAO与Pt@UiO_(0.01)、Pt@UiO_(0.01)、Pt@UiO₍₁₎和Pt@UiO₍₅₎孵化后的(e)圆二色谱图及(f)对应二级结构含量图。

本研究工作由天津大学姜忠义教授、石家福副教授团队完成，得到了新南威尔士大学梁康研究员的指导和帮助。该团队长期致力于生物催化、酶-光(化学)偶联催化等研究，曾将“隔室化-通道化”策略成功应用于多酶催化系统构建和应用过程(Adv. Funct. Mater. 2013, 23, 1450; ACS Catal. 2014, 4, 962; Chem. Soc. Rev. 2018, 47, 4295)。目前，团队正致力于将该思想拓展至酶-光偶联人工光合过程，并已取得积极进展。在研究过程中得到了国家自然科学基金(21621004，21776213)，天津市自然科学基金(19JCYBJC19700)，天津市合成生物技术创新能力提升行动项目(TSBICIP-KJGG-003)，化学工程联合国家重点实验室开放基金(SKL-ChE-19B01)和生化工程国家重点实验室开放基金(2020KF-06)的支持。

ACS Catal. 2020, 10, XXX, 9664–9673

Publication Date: July 29, 2020

https://doi.org/10.1021/acscatal.0c01985

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