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2021年4月香港中文大学理学院生命科学学院教授Shannon Wing-Ngor Au于Journal of lipid Research发表文章Structure of mouse cytosolic sulfotransferase SULT2A8 provides insight into sulfonation of 7α-hydroxyl bile acids ,该研究揭示了以7α-羟基为目标的胆汁酸磺化的结构基础,并阐明了不同物种间胆汁酸代谢的功能多样性。
胆汁酸起到脂质的肠吸收和功能中起重要作用作为信令调节脂质,胆固醇,葡萄糖,能量分子和核受体的活化剂,和胆汁酸代谢。然而,胆汁酸具有洗涤剂样性质和它们破坏血浆和线粒体膜脂质以高浓度。在人体内,胆汁酸的过多积聚可导致胆汁淤积等病理性肝胆改变。消除胆汁酸涉及磺化,葡糖醛酸化和羟基化。的胆汁酸磺化通过增加它们的水溶性,限制了它们的肝肠循环,并且提高他们的粪便排泄。
胞质磺基转移酶(SULTs)是一个大家族的酶催化两个异生素和内源性化合物,包括激素,神经递质的磺化的,和胆汁酸。磺化涉及磺酸盐(SO转移3 - )基团从通用辅因子3'-磷酸-5'-磷酸硫酸(PAPS)的羟基(OH)基团的底物以产生磺化产物。基于它们的氨基酸序列相似性,哺乳动物胞质SULTs分为六个家族(SULT1-SULT6),其中SULT1和SULT2是异源和内生代谢最大和最重要的家族。所有这六个SULT家族成员的蛋白质序列比对表明,辅因子结合的5'-磷酸-硫酸盐结合(PSB)和3'-磷酸结合(PB)基序是保守的。与此相反,对于基底区域结合是高度发散的。例如,在SULT1家族成员是主要负责酚,雌激素,和儿茶酚胺代谢,同时SULT2酶主要催化hydroxysteroids和胆汁酸。
图2:mSULT2A8与750 hSULT2A1的整体结构和衬底腔比较。
SULT2家族的成员进一步分为SULT2A和SULT2B子家族。人源hSULT2A1通过在肝中的3-OH基团的单磺化解毒胆汁酸。尽管先前已经鉴定了七个SULT2A基因(mSULT2A1-mSULT2A7),但它们的转录表达在mSULT2A7以外的成年小鼠中被抑制或沉默,其生物学功能尚不清楚。由于mSULT2A1与hSULT2A1具有高度的序列同一性,因此它被认为是3-OH磺化hSULT2A1的直向同源物,在人类胆汁酸解毒中起着至关重要的作用。然而,在小鼠显示了胆汁酸池的先前调查得知7-OH胆汁酸单硫酸盐是主要的形式,并且它们的水平是在男性尤其高于女性。这与仅在雌性小鼠中检测到的Sult2a1的肝mRNA表达模式相矛盾,表明在7-OH的胆汁酸磺化需要另一个SULT。作者的团队最近确定SULT2A8是小鼠SULT2A亚家族的新成员。SULT2A8主要在男性成年人中表达,重组SULT2A8优先催化7α-OH胆汁酸的磺化反应,包括胆酸(CA),鹅去氧胆酸(CDCA)及其结合形式。另外,RNA测序分析表明,Sult2a8在小鼠肝脏的所有8个Sult2a基因中都大量表达。最近的生理研究表明,SULT2A8介导的胆汁酸磺化与胆汁酸解毒有关,而SULT2A8表达的下调与胆固醇胆结石的形成有关。作者对SULT2A8单倍缺陷型小鼠模型的体内研究还表明,SULT2A8在维持肝牛磺酸缀合的CA的体内平衡方面至关重要,这是小鼠胆汁酸池中的主要比例。在一起,SULT2A8的病理生理作用变得更加清晰。
图3:mSULT2A8和hSULT2A1中胆汁酸的不同结合模式。
OH通过SULT2A8胆汁酸磺化的结构基础少理解。有趣的是,所有SULT的多序列比对揭示了保守的催化组氨酸(hSULT2A1中的His99)被SULT2A8中的亮氨酸取代。尽管有人提出将非保守的His48用作SULT2A8中胆汁酸磺化的催化残基,则无法理解其潜在的机械特征。在本研究中,作者已经解决了mSULT2A8与辅因子类似物腺苷3',5'-二磷酸(PAP)和7α-OH底物CA形成复合物的晶体结构。与hSULT2A1的结构比较表明,SULT2A8中胆汁酸的独特7α-OH磺化是由底物结合和非保守催化残基His48的差异模式引起的。此外,已经研究了SULT2A8与底物之间的相互作用,特别是底物结合环的作用。
图4:SULT2A8的活性位和催化残基
胆汁酸过多积累会导致胆汁淤积等肝胆改变。SULT介导的磺化是维持胆汁酸稳态的重要途径。与人类中通过SULT2A1通过胆汁酸进行3α-OH磺化不同,在小鼠中7-OH磺化是胆汁酸解毒的途径。与3-硫酸盐相比,7-硫酸盐对肠道的水解和细菌代谢更具抵抗力,从而降低了肠道的重吸收。作为7α-OH胆汁酸的首选SULT,SULT2A8似乎是消除小鼠胆汁酸的主要酶。有趣的是,保守的催化组氨酸(hSULT2A1中的His99)被SULT2A8中的亮氨酸取代,表明SULT2A8采用了独特的催化机制。在此,与PAP和CA配合使用的SULT2A8的晶体结构揭示了其用于底物识别和7α-OH磺化的结构基础。尽管SULT2A8与其他SULT一样共享辅因子的保守结合模式,但与复合了类固醇样底物(包括hSULT2A1,hSULT2B1,hSULT1A1,hSULT1E1和mSULT1E1)的SULT的结构比较表明,mSULT2A8中的底物完全不同。与底物接受磺酸盐的OH与保守的催化组氨酸非常接近(hSULT2A1中的His99),CA的7α-OH朝向His48和Lys44以及mSULT2A8中的辅因子的5'-磷酸基团。
作者的模型提供了结构证据,证明了His48如何作为底物去质子化的催化残基发挥作用,正如先前的研究所提出的那样。作者定点诱变研究的结果进一步表明,Lys44和His48都是7α-OH磺化的关键残基,尽管任何一个残基发生突变时都保留了40%的酶活性。与hSULT2A1相似,pH 5.5是mSULT2A8酶活性的最佳pH。参考组氨酸的理论pK R值(pK R = 6.0),His48在pH 5.5时处于质子化状态。然后这将与His48作为使胆汁酸的7α-OH去质子化的碱的作用不同。但是,pK R与PROPKA计算APO SULT2A8模型His48的值的方案是5.0,这表明在SULT2A8的活性位点降低其pK值周围的残留物和微环境- [R 。值得注意的是,PAPS结合和CA结合形式的His48的pK R分别降低到3.1和3.6,当两个配体同时存在时进一步降低到2.6。这一发现与从hSULT2A1模型(PDB ID,3F3Y)计算出的His99的pK R 2.5相当(表明,辅因子与底物的结合调节了胆汁酸去质子化的催化组氨酸的实际pK R)。
图5:SULT2A8及其突变体对不同胆汁酸的酶活性。
此外,mSULT2A8的结构具有独特的环2和环3构型。与其他与辅因子和底物共结晶的人类SULT1和SULT2同工型相比,mSULT2A8中的环2和环3处于“松弛”和“紧密”状态分别为“构象”。mSULT2A8中的环2和3似乎通过分别与侧链和类固醇骨架相互作用来稳定底物。在mSULT2A8中,等效残基Glu237与CA的12α-OH(3α-,7α-,12α-OH)形成氢键。酶活性和热稳定性测定进一步证实了Glu237在环3中的重要性,因为在E237A突变体中发现磺化活性和热稳定性显着降低。这也解释了为什么与CA相比,mSULT2A8对缺少12α-OH的CDCA(3α-,7α-OH)的磺化活性较低。另外,酶活性数据表明,相邻的残基Ile236在底物特异性中也起作用。I236S突变体对四种受试7α-OH胆汁酸的磺化活性均增加至可比较的水平。Ile236在人和小鼠SULT2A亚型(异亮氨酸,缬氨酸或丙氨酸)中高度保守。从hSULT2A1结构(PDB ID,3F3Y)来看,该疏水残基位于环3的铰链上,可能参与维持环的构象。然而,具体地,回路3中的Ile236如何调节底物特异性尚不清楚。在作者的研究中,与非结合形式相比,SULT2A8对牛磺酸结合胆汁酸的活性更高。作者推测,SULT2A8中环2的宽松构象可能有助于识别侧链结合的胆汁酸。
此外,有限的蛋白水解和热位移分析表明辅因子在稳定SULT2A8蛋白中的作用。天然底物的存在进一步增强了SULT2A8的热稳定性,这与hSULT2A1上的分子动力学模拟非常吻合。该结果表明底物结合可通过氢键和活性位点内的疏水相互作用诱导更紧密的结构折叠。这也解释了为什么在不存在辅因子或底物的情况下无法获得SULT2A8的结晶的原因。在小鼠中,PAPS(〜20μM)和T-CA(140μM )的肝水平比SULT2A8的K m 2.9μM高得多。)和21.1μM。作者推测,大多数SULT2A8蛋白在肝细胞中都能被PAPS和T-CA所稳定,因此T-CA的高磺化效率和体内稳态可能在小鼠中得以维持。
图6:SULT2A8在辅因子和底物存在下的稳定性。
本研究首次证明了HiS48介导的mSULT2A8中胆汁酸7α-OH磺化的机理细节。从作者的结构模型揭示的底物识别模式进一步提供了洞察力,以了解其他SULT2A同工型的磺化特性。通过多序列比对产生的谱图显示,hSULT2A1与mSULT2A1-mSULT2A7的遗传距离比与mSULT2A8的遗传距离更近。当比较hSULT2A1和mSULT2A8中胆汁酸的结合时,可以证明它们的系统发育关系(图3)。在mSULT2A1-mSULT2A7序列中发现了与hSULT2A1中胆汁酸骨架广泛疏水接触有关的相似残基,包括Phe139,Tyr231和Leu234。mSULT2A8中胆汁酸骨架的接触主要由Phe80,Leu99和Phe160引起。但是,在hSULT2A1和mSULT2A1-mSULT2A7中,前两个残基分别被极性残基(苏氨酸,丝氨酸或天冬酰胺)和催化组氨酸取代。作者推测这7个mSULT2A亚型将与hSULT2A1共享相似的底物识别和催化性能。有趣的是,除了保守的His99,mSULT2A3在第48位还具有一个额外的组氨酸。当CA停靠到由SWISS-MODEL,其方向与hSULT2A1中的LCA方向相当。在对接模型中,CA的His99与3α-OH(3.6Å)之间以及His48与7α-OH(5.0Å)之间的距离表明,mSULT2A3可能具有双重磺化特性,优选靶向3α-OH。
在人类中,hSULT2A1作为唯一的SULT2A亚型,优先催化雄激素前体DHEA以维持雄激素稳态,而LCA则降低其细胞毒性。如人,mSULT2A1也催化在肝脏两者DHEA和LCA。通过上调mSULT2A1,mSULT2A2,mSULT2A4和mSULT2A6的表达(尤其是mSULT2A1)来增强磺化是在高胆酸血症下由牛磺胆酸钠共转运多肽(一种共轭胆汁酸的肝转运蛋白)缺乏引起的LCA消除的主要途径。但是,mSULT2A8和PAPS合酶2的表达减少会增加疏水性初级胆汁酸的水平,并导致甲状腺功能减退小鼠体内胆固醇胆结石的形成。在成年小鼠(SULT2A成员的差动肝表达一起),这些结果暗示在胆汁酸代谢其具体的作用。mSULT2A1,mSULT2A2,mSULT2A4和mSULT2A6的诱导表达对于LCA的排毒至关重要,LCA是一种次要但毒性很强的仲胆汁酸,而mSULT2A8的高而恒定表达则有助于维持适当水平的初级胆汁酸,这主要是由于胆汁酸池总量的比例。为了进一步阐明人与小鼠之间胆汁酸磺化的代谢差异,未来的研究可以集中在其他mSULT2A亚型的结构和功能上。
原文链接:https://doi.org/10.1016/j.jlr.2021.100074
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