on>了解底物处理过程对设计聚酮合酶（PKS）产生新的代谢物很重要，而TE-domain（硫酯酶）是设计PKS系统中的一个重要瓶颈。本文探究了PKS模块中TE-domain的替换如何影响其处理天然和非天然底物的能力。研究人员通过结构域互换构建了一系列带有异源TE-domain的杂合PKS，其能有效处理非天然底物，并实现了产物多样化。本研究表明TE-domain可以作为蛋白质工程的目标，以促进产生聚酮天然产物类似物。
TE结构域是非天然底物合成中的主要催化区域，而含有与异源底物匹配的TE结构域的工程化PKS模块通常可以恢复聚酮化合物的合成。本文中，最初的实验试图使用来自苦霉素（Pik）和红霉素（DEBS）系统的两个模块和来自juvenimicin（Juv）途径的倒数第二个模块，将全长聚酮中间体（1-3，Figure 1a）转化为相应的macrolactones（4-8）。这些模块共享相似的结构域架构和将优化的聚酮底物转化为macrolactone类天然产物的能力（4、6、9-10，Figure 1b）。值得注意的是，PKS模块中酮还原酶（KR）结构域的存在与否会影响最终的macrolactones是否包含3-羟基（4，7）或3-酮（5，6）官能团。
Figure 1a. Reaction schemeof PKS modules processing their native full-length synthetic substrates 14a,24b, 34c to the corresponding macrolactones.
野生型PKS模块（Figure 1a）在体外可以有效地将天然底物加工成相应的macrolactones，而对非天然底物的利用率较低。与之前的报道一致，Pik Mod6-Pik TE可有效地将2转化为narbonolide（6）。虽然DEBS Mod6-DEBS TE产生了大量的3-hydroxy-narbonolide（7），但其他非天然反应中都不能从2产生明显可检测的6或7。最近，已经证明TE修饰对PKS处理非天然底物有显著影响。由此推断，含有非天然底物的反应的产率下降（Figure 1c），至少部分是由于TE结构域的无效催化造成的。
Figure 1. (b) Domainarchitecture of the PKS modules used in this study and the native macrolactone products fromeach respective biosynthetic pathway. (c) Table of percent conversion forreactions with substrates 1-3.
为了确定产量下降是否源于每个末端模块中聚酮中间体和TE结构域之间的相容性问题，研究人员设计获得了一系列PKS融合蛋白，将天然的TE结构域替换到异源系统中的相应结构域。模块选自功能相关的Pik、DEBS和Juv生物合成PKS（Figure 1b）。研究者使用1作为底物来测试杂合TE模块的灵活性，且所有杂合模块共享相同的结构域（KS-AT-KR-ACP-TE）。结果表明，当下游的Pik TE与引入的非天然中间产物（1）正确匹配时，这些PKS模块的KS-AT-ACP-KR结构域保持了适当的催化功能；即使底物（1）是PKS模块（Pik Mod5）的天然底物，DEBS和Juv 的TE结构域也不能有效地产生12元环macrolactone；TE结构域与天然聚酮底物配对显著提高了产物产量。因此，选择或修改模块内的TE可以增加产物产量和实现对非天然底物的加工（Table 1）。
Table 1. Evaluation of PKSTE hybrid modules with 1, the native substrate of Pik Mod5.
接下来，研究人员探究了杂合TE模块接受和转化六酮（2）为14元环macrolactones的能力（Table 2）。与使用1的结果类似，用DEBS或Juv TE结构域替换Pik Mod6中的同源Pik TE结构域导致Pik Mod6将2转化为6的能力严重降低。然而，当与DEBS Mod6反应时，2可转化为6和7。化合物7由DEBS和Juv TE融合蛋白产生，但与Pik TE反应时，有利于产生6。这一结果表明，当释放14元环时，各种TE结构域在C-3位置的功能与其固有的链延长中间产物相匹配。
Table 2. Evaluation of PKSTE hybrid modules with 2.
这些数据表明，TE结构域有效地环化高级聚酮中间体的能力取决于线性聚酮链中存在的官能团（Figure 2）。Pik Mod6的天然线性seco acid在C-3位是不还原的，它的同源TE显示出对这种ACP结合底物的偏好性。令人惊讶的是，当作为DEBS Mod6-Pik TE杂合体被替换到DEBS Mod6上时，Pik TE保持了其对3-酮基ACP链中间体的偏好，并选择性地催化环化到6。这一结果表明，未还原的ACP链中间体与非同源Pik TE的结合亲和力比与其自身天然KR结构域的结合亲和力更高。Pik TE与C-3酮中间体强烈相互作用的能力也可在1与DEBS Mod6-Pik TE反应产生5的反应中观察到。
Figure 2. Biocatalytic mechanism of the processing of 2 by DEBS Mod6.
研究者测试了杂合TEs与上游模块结合时保持活性的能力，这一相互作用对后期PKS改造至关重要，因为它确保了杂合蛋白在其他模块背景中正确发挥作用。使用3与Juv Mod6进行反应，Juv Mod6必须将延长的中间产物传递给Juv Mod7-TE进行额外的延伸和环化（Table 3）。结果表明，当与Juv Mod7融合时，DEBS、Juv和Pik TE结构域都具有生成16元环macrolactones的能力。对丁内酯（9）进行定量，发现Juv Mod6+Juv Mod7-Juv TE的效率最高（34%），接着是Juv Mod7-DEBS TE（30%）。这一结果不仅表明PKS混合TE模块在与上游模块一起使用时具有催化活性，而且还进一步支持了TE对3-羟基或3-酮官能团的选择性。
Table 3. Reaction of 3 withJuv Mod6 + Juv Mod7 TE hybrids.
在确定了TE结构域在工程化PKS系统中的关键作用后，尝试利用混合TE模块来生产非天然macrolactones。因此，利用杂合Juv Mod6 TE与底物3进行筛选，以探索产生预测的8的能力（Scheme 1），结果却产生了含有seco acid的吡喃13，其与8质量相同。这些结果表明，延伸的六酮很可能是作为seco acid从PKS模块中卸载出来的，它在半缩酮和seco acid之间快速相互转化，随后脱水生成最终的产物13。
Scheme 1. Reaction of JuvMod6-Pik TE with Tyl hexaketide 3 results in pyran 13, which is identical in mass to macrolactone 8.
综上，本文步深入了解了I型模块化PKS TE结构域的底物灵活性及其在PKS设计中的应用。TE结构域是将非天然底物转化为macrolactones和其他分子的关键催化结构域。同时， TE结构域的同一性也可能改变工程PKS模块中发生的催化事件的顺序。通过探索非天然TE结构域如何通过组合生物合成和定向途径工程化策略减少产物的形成，研究者将能够更有效地设计细菌I型PKS途径，以促进产生聚酮天然产物类似物。
目前评论：0