今天分享的是ACS Central Science上2019年1月K. N. Houk和Frances H. Arnold的ASAP的文章：A Biocatalytic Platform for Synthesis of Chiral α-Trifluoromethylated Organoborons

DOI:10.1021/acscentsci.8b00679

含氟化合物在现代医药中占据重要地位，超过20%的药物是含氟分子。虽然已经发展了大量有机氟化物的化学合成方法，但是酶法合成仍然欠缺。为扩展生物催化的氟化学，当前考虑两种方法。第一是通过蛋白质工程拓广氟化酶(fluorinase)的底物范围，第二是修改前体导向(precursor-directed)的生物合成路径使之接纳氟砌块(building block)。虽然已经取得重要进步，但是两种方法都有底物范围窄、效率低的缺点，限制其合成应用。

向天然存在的蛋白质引入非自然的化学是拓宽自然合成能力的有前景的手段。与非自然反应分享相似机理的酶可以催化混杂的非生物反应，并且从从中可以进化出新的活性。这里我们将机理引导的完全基因编码的酶用于有机氟化物的非自然方法合成。我们的目标反应是从三氟叠氮烷烃和Lewis碱型的硼烷出发合成手性α-三氟甲基有机硼化合物。这类有机硼化合物是有价值的合成砌块，可以通过多样的硼介导的转化反应合成含三氟甲基的分子。虽然α-三氟甲基有机硼化合物的合成多样性很好，但是其不对称制备仍充满挑战。目前有限的方法包括Cu催化的三氟甲基取代烯烃的不对称氢硼化和三氟甲基卡宾中间体对映选择性插入Lewis碱型硼烷B-H键。这两个反应的底物范围有限：氢硼化只能用于芳香β-CF3-α,β-不饱和酮，B-H键插入只用于芳基取代的三氟重氮化合物。

有限的制备α-CF3有机硼化合物的方法激励我们开发制备相应化合物的酶法平台，通过重新编码亚铁血红素(heme)蛋白催化三氟重氮烷烃产生卡宾插入B-H键，如图1。驾驭三氟重氮烷的易得性和heme蛋白的可进化性，可以合成目前不能得到的手性α-CF3有机硼化合物。其中的主要挑战是设计heme蛋白接受不同的CF3卡宾中间体，用于插入B-H键。虽然目前卡宾转移酶可以用于多种化学转化，但是重氮化合物的范围仅限于EDA(ethyl diazoacetate)。重新优化酶的活性位点可以扩大重氮底物的范围。另外目前的卡宾B-H键插入反应中，对映选择性仅在连有(杂)芳环的重氮碳底物中实现。

图1 (a) 手性α-CF3有机硼化合物合成的酶法平台； (b) 左侧是Rma cyt c和Rma TDE的结构以及含iron porphyrin carbene的Rma TDE的计算模建结构。蛋白前方loop区的显著变化凸显了loop突变可以接近Rma cyt c的催化核心；右侧是我们假设的催化核心环境，heme-卡宾中间体的取向可以被调整为烷基取代基R暴露给溶剂。

我们设想上述挑战可以用Rhodothermus marinus cytochrome c (Rma cyt c)的结构特点解决。 这个蛋白被证明是发展新的酶法卡宾转移反应的多样性很好的平台。野生型heme结合口袋被几个α-螺旋包围，其中两个由表面loop连接。实验室进化的包含IPC(iron porphyrin carbene)中间体的Rma cyt c TDE卡宾转移酶的结构揭示了定向进化中的单点突变使表面loop的柔性大幅提高，如图1b。Loop柔性提高使蛋白可以抵达更多野生型中未观察到的开放构象，这种构象加强了卡宾中间体和底物的作用。我们假设可以设计活性位点周围环境使CF3-卡宾中间体的CF3基团受限的指向heme口袋，大的烷基取代基R面向溶剂暴露的一侧，如图1b。这种构象中，CF3受限的朝向确保C-B键形成时的高对映选择性不受烷基R的影响。

为寻找能够稳定图1b中构象的突变，我们开展了Rma cyt c和氮杂环卡宾硼烷1和三氟甲基重氮苯2作为模型反应底物的定向进化。我们期望2中大的苯乙基侧链可以辅助定向到溶剂暴露一侧。具体的突变体和实验结果见图2。

图2 (a) 野生型Rma cyt c的X-ray结构。site-situration突变位点如图所示；(b) Rma cyt c催化NHC硼烷1和重氮化合物2合成α-CF3有机硼的定向进化实验结果，total turnovers (TTN)和主要对映异构体比例如图所示。

拿到最优突变体 Rma cyt c Y44I V75S M99A M100L M103D (后文标注为BOR-CF3) 后，我们探索了三氟重氮烷底物的范围，如图3。

图3 底物拓展

随后我们用分子模拟探索了立体选择性的控制因素以及突变的作用。75S和Y71间的氢键引导Serine的Cβ指向heme，如图4a，加入底物2后的模拟发现：Serine指向heme产生了更大的空腔以接纳CF3基团。因此2以专一的构象对接到蛋白中，如图4b；另外对接结果与图4c中的脱氮气过渡态很相似，这说明Serine一方面限制了底物构象，另一方面促进形成了铁-卡宾中间体。

图4 (a)75S和71Y的氢键作用和不含重氮底物时的空腔；(b) 重氮底物2在BOR-CF3中的结合方式，在引入V75S突变后二者的互补性很好；(c) 含重氮底物2的BOR-CF3与DFT优化的生成IPC中间体的过渡态。

CF3-卡宾与BOR-CF3结合的构象有两种形式，如图5a,b，二者主要差别在Fe-C键的轻微旋转。两种构象均以pro-R面暴露给活性空腔。反应空腔可以有效接纳硼烷底物1，硼烷结合构象与B-H插入过渡态构象相似。突变M99A和 M100L调节了loop区的动态构象并创造出合理的空腔结合底物1。突变M103D和 Y44I加快了重氮底物的结合并稳定卡宾中间体。

图5 (a) BOR-CF3与CF3-卡宾结合中间体500ns的分子模拟轨迹；(b) 代表性的两个构象；(c) DFT计算得到的卡宾插入B-H的过渡态。

(Aires酱目前有幸当面问过Houk的唯一一个问题就是Arnold的定向进化的计算化学预测，ps加州比印第安纳不知道好到哪里去了呜呜呜呜呜呜呜)

另一篇三氟甲基化合物的生物合成见Aires酱去年的推送：ACS Catal.|羰基还原酶还原α-卤代苯乙酮(三氟代)高对映选择性和活性的分子机制